۱-روش آگلوتیناسیون سریع با آنتی ژن ویژه این روش
۲-آزمون آگلوتیناسیون رایت در لوله
۱-۹- درمان بیماری:
درمان بیماران بر اساس رژیم های توصیه شده توسط کمیته فنی کشوری، به شرح زیر می باشد :
۱- بزرگسالان: کپسول ۳۰۰ میلی گرمی ریفامپیسین بهمراه داکسی سیلیکین ( ۱۰۰ میلی گرم) برای مدت حداقل ۸ هفته . تتراسیکلین ۵۰۰ میلی گرم ( هر ۶ ساعت خوراکی ) به همراه استرپتومایسین ( ۱ گرم عضلانی ) یا جنتامایسین ( ۵-۳ میلی یا کیلو گرم عضلانی ) برای مدت ۲ یا ۳ هفته.کپسول ۳۰۰ میلی گرمی ریفامپیسین بهمراه کوتریموکسازول بالغین ( ۲ قرص ) خوراکی به مدت حداقل ۸ هفته.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲- اطفال: قطره ریفامپسین به اضافه کوتریموکسازول به مدت حداقل ۸ هفته . ضمناً ترکیب کوتریموکساول به همرا جنتامایسین نیز توصیه می شود.
۳- زنان باردار: درمان زنان باردار شبیه درمان بزرگسالان با ترکیب کوتریموکسازول به اضافه ریفامپسین ، است فقط در ماه اول . ماه آخر حاملگی ریفامپسین به تنهایی تجویز می شود.(بروسلوزیس،۲۰۰۶)
توصیه لازم در درمان تب مالت :
۱- درمان تک دارویی در مورد تب مالت توصیه نمی شود. مگر در ماه اول و ماه آخر حاملگی.
۲- حداقل دوره درمان ۸ هفته و حداکثر آن بستگی به نظر پزشک معالج دارد .
۳- با توجه به اهمیت برنامه کنترل رشد جمعیت ، درمان مواد مبتلا به تب مالت با رژیم درمانی دارای ریفامپسین سبب بی اثر شدن قرص های کنتراسپتیو می شود.که به بیماران واجد شرایط باید آگاهی لازم داده شود .( بروسلوزیس،۲۰۰۶)
۴- برای کنترل نتیجه درمان بیمار،بررسی آزمایشگاهی به تنهایی توصیه نمیشود(بروسلوزیس،۲۰۰۶)
۱-۱۰- پیشگیری (واکسیناسیون) و ریشه کنی:
هیچ درمانی برای بروسلوز شناخته نشده است و راه های کنترل بیماری عمدتاً بر پایه پیشگیری ازبیماری از طریق واکسیناسیون گوساله ها با واکسن سویه ۱۹ قرار دارد. ریشه کنی بیماری با کشتاردام های آلوده بعد از مشخص شدن آزمایش های سرم خون و شیر، و واکسیناسیون انجام می گیرد. از لحاظ اطمینان حیوانات مظنون را از بقیه جدا کرده و در محل مخصوصی با در نظر گرفتن شرایط وپیش بینی های لازم نگهداری می کنند. نکته مهمتر اینکه نباید دام جدیدی را به گله اضافه کرد مگراینکه از سلامتی آن اطمینان حاصل شده باشد. (آشفورد و همکاران،۲۰۰۴)
برای ایمن نمودن دام ها علیه این بیماری باید بره و بزغاله های نر و ماده جایگزین را قبل از شیرگیری واکسینه نمود. واکسن بروسلوز یک واکسن زنده بوده و لذا تزریق یکبار آن در حدود سه تا شش ماهگی(قبل از سن آمیزش) برای طول دوره اقتصادی دام کافی است. معمولا میزان تزریق معادل ۱ سی سی است که به صورت زیر جلدی در ناحیه پشت کتف و یا گردن تزریق می شود در مبارزه علیه بروسلوز، واکسیناسیون نقشی اساسی دارد. تاکنون واکسن های متعددی از سویه های زنده یا کشته ی بروسلا آبورتوس، بروسلاملی تنسیس و بروسلاسوئیس جهت ایمن سازی گاو، گوسفند و بز، خوک، شتر و دیگر حیوانات مورد استفاده قرارگرفته است، واکسیناسیون در انسان نیز به طور محدود انجام پذیرفته است.(اسکندروس و همکاران،۲۰۱۱)
مهمترین واکسن های مورد مصرف دامپزشکی را واکسن زنده ی سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس، واکسن زنده و کشته ی سویه ی ۲۰/۴۵ بروسلا آبورتوس، واکسن زنده ی سویه ی موکوئیدی M ۱۰۴ بروسلا آبورتوس، واکسن کشته ی سویه یH ۳۸ بروسلاملی تنسیس، واکسن زنده ی سویه ی Rev1 بروسلاملی تنسیس، واکسن زنده ی سویه یS۲ و غیره شامل می گشتند. شاخص های آنتی ژنیک در بروسلا زیاد هستند که از شاخص های عمده آن می توان لیپوپلی ساکارید(LPS) ، پروتئین های سیتوپلاسمی و پروتئینهای غشاء خارجی را نام برد. بروسلا به چند دلیل دارای بیماریزایی غیر معمول می باشد اولا فاقد فاکتورهای بیماریزایی کلاسیک نظیر اگزوتوکسین یا اندوتوکسین می باشد و بیماریزایی LPS آن بطور تیپیک شبیه LPS بقیه باکتری های گرم منفی نیست ، ثانیا بروسلا دارای تمایل به تهاجم و ماندگاری در میزبان انسانی از طریق مهار مرگ سلولی است. بیان عوامل ژنی خاص در باکتری بروسلا باعث می شود که بتواند شرایط سخت داخل سلولی را تحمل کند. از جمله این عوامل می توان به پروتئینهای شوک حرارتی اشاره کرد. بعد از اینکه باکتری در سلول همانند سازی کرد ، با کمک همولیزین ها آزاد شده و باعث نکروز سلولی می گردد سپس باکتری های تکثیر کرده می توانند وارد سلولهای دیگر شده و از این طریق می توانند به سرعت در سلولها و بافتهای مختلف گسترش یابند و باعث آسیب رساندن به بافتهای مختلف گردند.(بروسلوزیس ۱۹۹۷) اولین واکسن بروسلا برپایه سویه ۱۹ بروسلا آبورتوس است. این واکسن حفاظت مناسبی در مقابل بروسلا آبورتوس در گاو ایجاد می کند سویه واکسن بروسلا آبورتوس RB51 یک نمونه موتانت خشن^[۲۴] و مقاوم به ریفامپین است که جایگزین سویه S19 برای واکسیناسیون گاو گردید. در حال حاضر سویه زنده تخفیف حدت یافته بروسلا ملیتنسیسRev1 بطور گسترده بعنوان واکسن در مقابل بروسلا ملیتنسیس در گوسفند و بز استفاده می گردد.تاکنون هیچ واکسن انسانی بروسلا بخصوص در اتحادیه اروپا و آمریکا مجوز نگرفته است چون تمام واکسنهای حیوانی حتی سویه بروسلا آبورتوس RB51 و سویه بروسلا ملیتنسیسRev1 برای انسان بیماریزا هستند)جین کونگ و همکاران،۲۰۰۳).
استفاده از یک مشتق از سویه S19 بروسلا آبورتوس بصورت زیر جلدی یا تیغ زدن بر روی حداقل ۳ میلیون نفر در جمهوریهای آسیایی شوروی سابق باعث شد که ۱۱-۵ برابر میزان بروسلوز انسانی فصلی را در آن مناطق در دهه ۱۹۵۰ کاهش دهد. این واکسن ایمنی کوتاه مدت داده و نیاز به دوز تقویت کننده^[۲۵] دارد. سویه بروسلا آبورتوس ۱۰۴M در چین استفاده شده است ولی اطالاعات زیادی از آن موجود نمی باشد. فراکشن پپتیدوگلیکان محلول در فنل از بروسلا ملیتنسیس سویه M15 در فرانسه استفاده شده است ولی میزان ایمنی زایی مناسبی نداشته است(جین کونگ و همکاران،۲۰۰۳ ؛ هوور و همکاران،۱۹۹۹).
کاملا مشخص شده که پروتئینهای غشاء خارجی (Omps) گونه بروسلا از خاصیت ایمونوژنیک و حفاظت زایی بالقوه ای برخوردار هستند. ایمنی زایی غیر فعال در موش نشان داده که مخلوطی از آنتی بادی های منوکلونال ضد چند پروتئین غشاء خارجی بروسلا حفاظت ضعیفی در مقابل سویه های صاف بروسلا ایجاد کرده و یا اصلا هیچ حفاظتی ایجاد نکردند در حالیکه در مقابل سویه خشن بروسلااویس حفاظت ایجاد کردند. حفاظت زمانی بهتر بود که آنتی بادی منوکلونال ضد Omp31 در مخلوط موجود بود. واکسیناسیون با مخلوط دارای Omp31 باعث القای واکنش آنتی بادی قوی شده ولی پاسخ سلولی ضعیفی ایجاد کرد و حیوانات واکسینه شده را در مقابل چالنج با بروسلا اویس محافظت کرد ولی در مقابل چالنج با بروسلا ملیتنسیس محافظتی ایجاد نکرد(کاساتارو و همکاران،۲۰۰۵).واکسن DNA کد کننده پروتئین Omp31 بروسلا ملیتنسیس: ایمنی زایی موش با این واکسن باعث ایجاد حفاظت ناقص در مقابل بروسلا اویس و بروسلا ملیتنسیس گردید. موشهای ایمن شده با این واکسن پاسخ همورال خیلی ضعیفی را نشان دادند و فاقد پاسخ Th1 بودند ولی سلولهای TCD8 را تحریک کرد. حفاظت ایجاد شده در ارتباط با القاء سلولهای TCD8 اختصاصی Omp31 بوده که سلولهای آلوده به بروسلا را از طریق مسیر پرفورین^[۲۶] حذف می کند این واکسن پاسخ سایتوتوکسیتی را القاء کرده و در نتیجه باعث حفاظت در مقابل بروسلا گردید(کاساتارو و همکاران-۲۰۰۵). استفاده از واکسن DNA پلاسمیدی حامل ژن Omp31 در مرحله اول و سپس بعنوان تقویت کننده^[۲۷] استفاده از پروتئین نوترکیب Omp31 همراه با ادجوانت ناقص فروند در موش و سپس چالنج با بروسلا بویس و بروسلا ملیتنسیس باعث پاسخ ایمنی و محافظت گردید. تیتر IgG1 و IgG2 در سرم نسبت به استفاده به تنهایی واکسن پلاسمیدی و پروتئین نوترکیب بیشتر بود. اسپلنوسیتهای این حیوانات سطح بالایی از اینترفرون گاما نسبت به استفاده به تنهایی واکسن پلاسمیدی و پروتئین نوترکیب تولید کردند در مقابل ، سطح اینترلوکین ۲ تولید شده با دو سری دیگر قابل مقایسه بودند. هیچ کدام از انواع ایمن شده دارای اینترلوکین ۴ نبودند. قابل توجه اینکه پروتئین نوترکیب Omp31 که به عنوان تقویت کننده تزریق گردید ، تولید IL10 را تحریک کرد در حالیکه در دو سری دیگر (پروتئین نوترکیب و واکسن پلاسمیدی به تنهایی) IL10 تولید نگردید. بطور کلی استفاده ازواکسن پلاسمیدی در ابتدا و سپس پروتئین نوترکیب بصورت بوستر باعث گسترش مناسب حفاظت در مقابل چالنج با بروسلا بوویس و بروسلا ملیتنسیس گردید. (کاساتارو و همکاران،۲۰۰۷)
استفاده از پروتئین پریپلاسمیک bp26 و ژن پروتئین چاپرون فاکتور تریگر(TF) این دو ژن از روی ژنوم بروسلا ملیتنسیس ۱۶M جدا شده و در پلاسمید pcDNA3.1 بطور جداگانه کلون شده و پلاسمیدها بصورت درون عضله ای بطور جداگانه و ترکیبی به موش تزریق شدند. سطح حفاظت مناسبی در موشهای ایمن شده بعد از چالنج با بروسلا ملیتنسیس مشاهده گردید که سطح حفاظت در موشهایی که بطور ترکیبی با هر دو پلاسمید نوترکیب ایمن شده بودند بیشتر بود. هر دو پلاسمید باعث القاء تولید IgG و اینترفرون گاما شدند ولی bp26 به تنهایی باعث القاء IL4 ، IL5 وIL6 شد.ویزکاینو و همکاران(۱۹۹۶) نتایج نشان می دهد که این دو پروتئین کاندیدهای عالی جهت استفاده به عنوان واکسن در مقابل بروسلوز می باشند یانگ و همکاران،(۲۰۰۵). استفاده از ژنهای sodC ، لومازین سنتتاز و P39 (باکتریوفرین) ژن P39 از بروسلاهای بیماریزای مختلف جدا و بر روی پلاسمید کلون گردید. ژن سوپر اکسید دسموتاز(sodC) و لومازین سنتتاز از بروسلا آبورتوس جدا گردید. ایمنی زایی با بهره گرفتن از پلاسمیدهای حامل این ژنها در موش باعث ایجاد حفاظت ناقص بعد از چالنج گردید(یانگ و همکاران،۲۰۰۵؛ویزکاینو و همکاران،۱۹۹۶).
۱-۱۰-۱تولید پروتئین نوترکیب Omp31
تولید پروتئین نوترکیبOmp31 با وزن kDa 31 از بروسلا ملیتنسیس و فرمولاسیون آن با ادجوانت ناقص فروند و تزریق بصورت زیرجلدی در موش باعث پاسخ ایمنی سلولهای TCD4(Th1) شده ودر مقابل بروسلا بویس و بروسلا ملیتنسیس ایمنی ایجاد کرد. این واکسن باعث القاء پاسخ IgG با تیتر بالای IgG1 و IgG2 گردید. همچنین در سلولهای طحال موشهای ایمن شده با این واکسن IL2 و اینترفرون گاما تولید گردید اما IL10 و IL4 تولید نشد(یانگ و همکاران،۲۰۰۵؛راجان،۲۰۰۲).
۱-۱۰-۲ استفاده از NPAP
ارتباط نزدیک ژنتیکی و آنتی ژنیک بین بروسلا و آلفاپروتئوباکتریا های غیر بیماریزا^[۲۸](NPAP) در چندین مقاله مورد بررسی گردیده است. موشهایی که بصورت زیر جلدی با باکتری هایی با حرارت کشته شده اکروباکترمنتروپی^[۲۹]،مزوریزوبیوم۳،آگروباکتریوم تومفسینس۴و سینوریزوبیوم۵و بروسلا آبورتوس سویه H38بعنوان کنترل مثبت ایمن شده بودند مورد چالنج با بروسلا آبورتوس سویه ۲۳۰۸ قرار گرفتند. ۳۰ روز پس از چالنج میزان CFU طحالی بطور قابل ملاحظه ای در موشهای ایمن شده با این باکتری ها پایین بود. از NPAP بصورت زنده وخوراکی در موش استفاده گردید و با بروسلا آبورتوس بصورت خوراکی چالنج شدند. ایمنی زایی با NPAP باعث القاء قابل ملاحظه IgG گردید. در مورد تمام انواع NPAP بکار برده شده ، سطح ایمنی بالاتر از ایمنی زایی سیستماتیک بوده ولی نسبت به ایمنی زایی خوراکی با بروسلا آبورتوس با حرارت کشته شده پایین تر بود. این نتایج نشان می دهد که ایمنی زایی با NPAP بخصوص O. anthropi باعث ایجاد حفاظت ناقص (partial) در مقابل چالنج با بروسلا آبورتوس کرد(دلپینووهمکاران ،۲۰۰۷؛راجان،۲۰۰۲).
۱-۱۰-۳ استفاده از بروسلا ملیتنسیس سویه WR201
سویه WR201 ازایجاد شکست بر روی اپرون purEK و جایگزینی آن با ژن مقاومت به کانامایسین در بروسلا ملیتنسیس ۱۶M در سال ۱۹۹۵ ایجاد گردید. این سویه جهت رشد بر روی محیط حداقل نیاز به پورین دارد در نتیجه بر روی محیط کشت سلولی ماکروفاژ انسانی با دشواری تکثیر می یابد. بعد از تزریق داخل صفاقی موش ، این سویه در کبد ، شش و طحال کلنی ایجاد کرده و به مدت چهار هفته در طحال پایدار می ماند و بعد از هشت هفته از هر سه عضو پاک می گردد وهر دو پاسخ ایمنی سلولی و همورال القاء می شود. علاوه بر آن این واکسن موشها را در مقابل انتشار سیستماتیک باکتری بعد از چالنج بصورت تنفسی با سویه ۱۶M محافظت کرده و باعث پاک شدن باکتری از ریه ها می گردد. در داخل سرم آنتی بادی های ضد LPS و آنتی ژنهای دیگر مشاهده گردید. اسپلنوسیتهای حیوانات ایمن شده IL2 ، اینترفرون گاما و IL10 آزاد می کنند(هوور و همکاران ،۱۹۹۹).
۱-۱۰-۴ استفاده از پروتئینهای غشاء داخلی ۱۶ و ۱۹ (Omp16 & Omp19) بروسلا آبورتوس
این پروتئینها از باکتری بروسلا آبورتوس جدا شده و با و بدون ادجوانت ناقص فروند فرموله شده و بر روی موش تست شده است که در مقابل آلودگی با بروسلا آبورتوس محافظت مناسبی را نشان دادند. البته نمونه های بدون ادجوانت ناقص فروند باعث حفاظت بالاتری شدند. سطح حفاظت ایجاد شده توسط واکسنهای تست شده بدون ادجوانت مشابه ایمنی زایی بوسیله بروسلا آبورتوس S19 بوده و باعث القاء سلولهایT اختصاصی CD4 و CD8 و تولید اینترفرون گاما و القاء پاسخ ایمنی سلولهای Th1 شدند. استفاده از این پروتئینها همراه با ادجوانت هیدروکسید آلومینیوم یک حفاظت سیستمیک ایجاد کرد و همراه با توکسین کلرآ به عنوان واکسن باعث حفاظت خوراکی در مقابل بروسلا آبورتوس گردیدند. هر دو حالت ایمنی زایی ، حفاظت یکسانی را مقابل واکسنهای S19 و RB51 نشان دادند. بطور کلی این نتایج نشان می دهد که پروتئینهای Omp16 یا Omp19 بدون ادجوانت ناقص فروند می توانند کاندید مناسبی به عنوان یک واکسن زیر واحدی در مقابل بروسلوز انسانی یا حیوانی باشند(پاسکوویچ و همکاران،۲۰۰۹).
۱-۱۰-۵ تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهای manBA ، virB2 و asp24در هر دو سویه بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس
جهش بر روی asp24 باعث تسلط بر آنتی ژن O و سیستم ترشحی نوع ۴ می گردد ، این می تواند یک کاندید ایده آل جهت بررسی اهمیت این دو عامل بیماریزای مهم در کارایی واکسن باشد. جهش بر روی ژن virB2 باعث عدم پایداری باکتری در ماکروفاژ می گردد. موتانتهای خشن manBA بعد از یک هفته از واکسیناسیون در موش تعدادشان به شدت کاهش پیدا کرد ولی پنج هفته زمان نیاز بود تا کاملا زدوده گردند. موتانتهای virB آهسته تر از موتانت manBA پاک شده که نشان دهنده این است که نقص آنها باعث زنده ماندن آنها در مراحل دیگر عفونت می گردد. موتانتهای asp24 خیلی آهسته تر یعنی بعد از ۱۶-۱۰ هفته از سلولهای موش پاک شدند که نشان دهنده این است که Asp24 ممکن است فقط برای پایداری میکروارگانیزم نیاز باشد. موتانتهای asp24 موش را در مقابل عفونت و چالنج در تمام زمانها بهتر از دو موتانت دیگرو حتی واکسنهای موجود حفظ کرده لذا این سویه بهترین کاندید برای واکسن تخفیف حدت یافته است(مک دوناگ و همکاران،۲۰۰۶).
۱-۱۰-۶ جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS
همانطور که قبلا آمد یکی از مشکلهای واکسن Rev1 به دلیل ایجاد آنتی بادی علیه LPS آن ایجاد مشکل در تشخیص دام بیمار از دام واکسینه می باشد. اگر بر روی ژن یا ژنهای دخیل در سنتز LPS جهش ایجاد شود این مشکل رفع شده و ممکن است از بیماریزایی آن نیز برای انسان کاسته شود. در یک تحقیق در سال ۲۰۰۷ تعدادی باکتری موتانت بروسلا ملی تنسیس که بطور اتفاقی جهشهایی بر روی ژنهای دخیل در سنتز اولیگوساکارید مرکزی(core) و O-پلی ساکارید انجام شده بود جدا گردید. تمام سویه ها بر روی موش بصورت زیر جلدی بررسی شدند که فقط دو سویه موشها را در مقابل دوز ۱۰۰۰ برابری سویه Rev1 محافظت کردند. این دو سویه دارای جهش بر روی ژنهای دخیل در انتقال و تجمع O- پلی ساکارید بودند و بطور ضعیف تولید آنتی بادی های ضد LPS سویه های صاف را القاء میکردند. نتایج نشان داد که هیچ موتانت خشنی برابر با Rev1 در مدلهای آزمایشگاهی نبوده و سویه های واکسن خشن جهت کنترل بروسلوزیس در مناطق اندمیک مناسب هستند(گونزالز و همکاران ،۲۰۰۸) .
۱-۱۰-۷ استفاده از LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس
LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس به تنهایی یا با پروتئین غشاء خارجی نایسریا مننژیتیدیس گروه B به عنوان کمپلکس غیر کووالانت بصورت زیر جلدی و تنفسی بر روی موش تست گردید. دو دوز از واکسن به فاصله چهار هفته استفاده گردید. موشهای ایمن شده ، چهارهفته بعد از آخرین دوز واکسیناسیون با بروسلا ملیتنسیس ۱۶M بصورت تنفسی چالنج شدند. بعد از هشت هفته از چالنج ، محافظت مناسبی در برابر گسترش عفونت در کبد و طحال موشهای ایمن شده بصورت تنفسی مشاهده گردید. موشهایی که بصورت زیر جلدی ایمن شده بودند محافظت مناسبی در کبد ، طحال و ریه ها نشان دادند(باتاچارژی و همکاران،۲۰۰۶).
۱-۱۰-۸ استفاده از پروتئین CP24
ژن (cp24)ribosome recycling factor (RRF)-homologous protein بروسلا ملیتنسیس کلون و در E.coli بیان گردید. این پروتئین نوترکیب در موش چالنج شده با بروسلا ملیتنسیس باعث واکنش ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH) گردید. ژن این پروتئین بر روی پلاسمید pcDNA کلون و به عنوان یک DNA واکسن به موش تزریق گردید. همچنین پروتئین نوترکیب نیز با ادجوانت به موش تزریق گردید. DNA واکسن باعث القاء تولید IgG2 گردید در حالیکه پروتئین نوترکیب باعث القاء تولید IgG1 گردید و هر دو روش باعث القاء تولید سلولهای تولید کننده اینترفرون گاما شدند. پروتئین نوترکیب باعث تولید IL10 گردید ولی DNA واکسن نتوانست. هیچکدام قادر به حفاظت موش در مقابل چالنج با بروسلا ملیتنسیس نشدند(کاساتارو و همکاران،۲۰۰۲).
۱-۱۰-۹ نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانی بروسلا ملیتنسیس
بطور کلی مناسبترین واکسنی که علیه بروسلا می تواند مورد استفاده قرار گیرد یک واکسن زنده تضعیف شده بدون OPS می باشد زیرا ۱- یک سویه بروسلا زنده می تواند در میزبان پایدار بوده و پاسخ ایمنی Th1 را تحریک کرده و آنتی ژنهایی را که سلولهای B و T را تحریک کنند فراهم کند. ۲- فقدان OPS می تواند به عنوان یک مارکر شناسایی جهت تمایز حیوانات آلوده شده و واکسینه مورد استفاده قرار گیرد. بنابر این با جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز اولیگوساکارید مرکزی(core) و O-پلی ساکارید در سویه Rev1 میتوان یه چنین سویه ای دست یافت.(شریفات و همکاران،۲۰۰۸؛اسپیرا و همکاران،۲۰۰۶)
۱-۱۰-۱۰ مجوز استفاده از واکسن بروسلا ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در گاوها
در فوریه ۱۹۹۶ مجوز سازمان بازرسی سلامتی حیوانات واکسن بروسلا ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در احشام بعنوان بخشی از برنامه دولت فدرال برای ریشه کنی تب مالت صادر شد.بروسلا ابورتوس سویه RB51 ثبات ژنتیکی دارد.جهش مورفولوژی سخت که فاقد زنجیره های پلی ساکاریدی بر روی سطح باکتری است . این زنجیره جانبی باعث گسترش تشخیص پاسخ انتی بادی یک حیوان به الودگی بروسلا است.بنابراین واکسن سویه RB51 موجب تولید انتی بادی ها بر اساس تست های تشخیصی استاندارد نمی شود. واکسن ما حصل سایر شکلهای انتی بادی هاست که می تواند کشف شود با یک ازمایش ویژه اگر یک حیوان واکسینه شده است این باعث یک پاسخ سلولی می شود که وظیفه اش در درجه اول برای محافظتش در برابر بروسلوز است.سویه RB51 موثرتر از واکسن بروسلا ابورتوس سویه ۱۹ است اما بسیار کمتر در گاوها ابورتیژنیک است.این باعث هیچ گونه علایم بالینی پس از واکسیناسیون نمی شود, و باعث واکنش موضعی در محل تزریق واکسن هم نمی شود.ارگانیسم از جریان خون ظرف سه روز پاک می شود و در ترشحات بینی و بزاق یا ادرار هم وجود ندارد.ضعف دستگاه ایمنی باعث عود کردن نیست و ارگانیسم از گاوهای واکسینه شده به گاوهای واکسینه نشده گسترش نمیابد. در همه ی گاوهایی که بیش از سه ماه عمر دارند واکسن بی خطر است.در صورتی که انسان در معرض آن قرار گیرد سویه RB51به طیف وسیعی از آنتی بیوتیکهای مورد استفاده در بروسلوزیس انسانی حساس است اما به ریفامپین و پنی سیلین مقاوم است.(کاروف و همکاران،۱۹۸۴؛اوگالد و همکاران،۲۰۰۰)
واکسن سویه RB51باید توسط دامپزشک معتبر تجویز شود یا توسط اداره ایالتی یا فدرال سلامتی حیوانات.گوساله ها باید با دوز گوساله بین سن چهار ماهگی تا یک سالگی واکسینه شوند.واکسیناسیون باید با وسایل فلزی مخصوص و بصورت زیر پوستی انجام شود.واکسیناسیون زیر پوستی همان واکسن سویه ۱۹ بروسلا آبورتوس است.در حال حاضر واکسن سویه ۱۹ بروسلا آبرتوس از بازار یا از برنامه ریشه کنی بروسلوز جمع آوری نشده است. اما سازمان بازرسی سلامتی حیوانات توصیه می کند که واکسن سویه ۱۹ متوقف شود.و برخی ایالتها دیگر اجازه واکسیناسیون با سویه ۱۹ را نمی دهند.واکسن بروسلا ابورتوس سویه RB51 هنوز برای استفاده عمومی در گاومیشها مورد تایید نیست. مطالعات اولیه نشان میدهد کهRB51 برای گوساله ها و گامیشها بی خطر و موثر است. اما به منظور مجوز مشروط برای RB51 در گاومیشها ازمایشهای ایمنی و اثر بخشی باید تکمیل شوند.( کاروف و همکاران،۱۹۸۴؛اوگالد و همکاران،۲۰۰۰)
گوساله های گاو میش می توانند توسط سویه RB51 واکسینه شوند به عنوان بخشی از آزمایشهای مزرعه بی خطر قبل از اینکه شروع به گرفتن مجوز کند.الزامات مورد نیاز برای شرکت در آزمایش این است که همه واکنشهای غیر طبیعی یا مشکلات بالینی مرتبط با واکسیناسیون به اداره کشاورزی ایالت متحده و سازمان بازرسی سلامتی حیوانات و گیاهان و سازمان دامپزشکی و تحقیقات دامپزشکی گزارش شود.(ویزکاینو و همکاران،۱۹۹۶)
واکسیناسیون گاومیشها به عنوان بخشی از آزمایشات مزرعه بی خطر به رسمیت شناخته خواهد شد.که موجب واکسیناسیون رسمی و نمودار واکسیناسیون و شناسایی مناسب خواهد شد تحت عنوان روشها و قوانین برنامه ریشه کنی بروسلوزیس.واکسن بروسلوز زنده بروسلا ملیتنسیس سویه Rev 1 خشک و منجمد برای مصارف دامپزشکی واکسن بروسلوز (زنده) بروسلا ملیتنسیس سویه Rev 1 خشک و منجمد برای مصارف دامپزشکی یک سوسپانسیون منجمد و خشک از سویه Rev 1 بروسلا ملیتنسیس زنده است. واکسن شامل حداقل و حداکثر باکتری زنده در هر دوز است.بروسلا ملیتنسیس سویه ۱Rev در یک محیط مناسب متوسط بدست میآید.روش بدست آوردن به اینگونه است که برای حفظ ویژگی باکتری ها باید از تجزیه آنها جلوگیری کرد. باکتریها در یک محلول بافر معلق میشوند که ممکن شامل معتدل کننده مناسب باشد .محلول سوسپانسیون در ظروف تقسیم شده قرار میگیرد.(راجان،۲۰۰۲)
انتخاب سویه واکسن: فقط یک سویه واکسن نشان داده است که میتواند از نظر ایمنی در ساخت واکسن رضایت بخش باشد.(آشفورد و همکاران،۲۰۰۴)
ایمنی: ۴۰ گوسفند ماده با سن ۴ یا ۵ ماه از یک گله که واکسینه نشده است بدون ابتلا به بروسلوز استفاده شده است.برای بدست آوردن سویه بهتر بروسلا ملیتنسیس به مدت ۲۴ ساعت در محیط آزمایشگاه کشت داده شد.سویه H38 مورد استفاده قرار گرفت.در تست مقدماتی از حیواناتی با نژاد و سن یکسان استفاده شد.با توجه به تست اصلی انجام شده برای مشخص کردن دوز که بین و واحد تشکیل دهنده کلونی است و بعنوان عامل سقط جنین در همه حیوانات غیر واکسینه شناخته میشود.(۳۵). نیمی از حیوانات واکسینه شده که عمرشان بین ۴ تا ۶ ماه است با توجه به برنامه های توصیه شده و استفاده از حداقل دوز توصیه شده.دوره آمادگی برای تولید مثل در ۴۰ حیوان با هم هماهنگ شده وقتی در سنین ۱۰ تا ۱۲ ماهگی باردار شده اند.تست بارداری در کلیه حیوانات ۲ تا ۳ ماه پس از تلقیح انجام شد و همه حیواناتی که آبستن نبودند از آزمایش حذف شدند.همه حیوانات باردار با لقاح ملتحمه با دوز مورد نظر از بروسلا ملیتنسیس سویه H38 مورد آزمایش قرار گرفتند.توسط این آزمایش سقط جنین قابل ملاحظه با تایید ایتولوژی برای سویه مورد نظر در گاوها بدست آمد.آزمایشها برای سویه مورد بحث روی حیوانات در بدو تولد انجام شد.آزمایش برای سویه مورد نظر در غدد لنفاوی پرسکاپولار^[۳۰] و رتروماماری^[۳۱] و انجام شد و چهار تا شش هفته پس از تولد موجب مرگ آنها شد.تست معتبر نیست مگر اینکه حداقل ۷۰ درصد حیوانات غیر واکسینه شده،علائم سقط جنین به دلیل سویه مورد نظر را نشان دهند، عفونت توسط سویه مورد نظر در موقع تولد رخ داده است، نشان دهند عفونت غدد لنفاوی پرسکاپولار و رتروماماری در هنگام مرگ وجود داشته است.واکسن با تست مطابق است اگر ، کمتر از ۳۰ درصد حیوانات واکسینه شده به خاطر سویه مورد نظر دچار سقط جنین شده باشند.سویه مورد نظر در بیش از ۵۰ درصد حیوانات واکسینه شده در هنگام تولد یافت نشود و سویه مورد نظر در بیش از ۴۰ درصد حیوانات واکسینه شده در هنگام ذبح یافت نشود.( آشفورد و همکاران،۲۰۰۴)
بروسلا ملیتنسیس موجود در واکسن توسط مورفولوژیستهای شایسته،آزمایشهای سرم شناسی و بیوشیمی و کشت در آزمایشگاه شناسایی شد.سویهRev1 با اضافه کردن ۳میکروگرم بنزیل پنیسیلین سدیم در میلی لیتربه محیط کشت ایجاد شد.سویه روی آگار شامل ۵/۲میکروگرم استرپتومیسین رشد کرد.پیشگیری از این بیماری با واکسیناسیون دامها، از بین بردن دامهای آلوده و نیز پاستوریزاسیون محصولات لبنی حاصل میشود. هر چند برای دامها واکسنهای تجاری که سویه های تخفیف حدت یافته اند ، استفاده میشود . اما استفاده از آنها موجب بروز اختلال سرولوژیک در روش های تشخیصی شده و موجب بیماری انسان نیز میشوند آشفورد و همکاران،(۲۰۰۴) . لذا نیاز است که استراتژی طراحی واکسن ها جهت بروسلوز مورد بازنگری قرار گیرد. یکی از این استراتژیها، استفاده از واکسنهای زیر واحدی است .ایمنی موثر نسبت به بروسلوز ایمنی سلولی است اسکندروس و همکاران،(۲۰۱۱).بر خلاف بروسلوز حیوانی، واکسنهای تأیید شده ای برای پیشگیری از بروسلوز انسانی هنوز در دسترس نیست. لذا چاره جویی برای یافتن راه حلهای دیگری جهت واکسیناسیون انسان و دام با بهره گرفتن از انواع آنتی ژنهای پروتئینی و غیر پروتئینی بروسلاها و یا ترکیبی از آنها لازم به نظر می رسد . به منظور ساخت این واکسنها پی بردن به خواص آنتی ژنیک و شیمیایی انواع آنتی ژنهای بیان شده در این باکتری ا لزامی است. پروتئینهای غشای خارجی بروسلا در ایجاد پاسخ ایمنی سلولی در این باکتری نقش کلیدی دارند. به همین خاطر تعدادی از این پروتئینهای غشای خارجی کلون و بیان شده اند.( اسکندروس و همکاران،۲۰۱۱)
پروتئین های بروسلا ملیتنسیس شامل kDa 20 , kDa 28 , و kDa 31 , پروتئینهای غشای خارجی بروسلاآابورتوس شامل kDa 17 , kDa 16.5 , kDa 25 , kDa 22 , kDa 36 , و پروتئین kDa 25 بروسلا اوویس(۶۲) Omp31 یک پروتئین غشای خارجی است که در سطح بروسلا ملیتنسیس صاف قرار دارد و کاندیدای واکسن زیر واحدی در برابر بروسلوز است.( ویزکاینو و همکاران،۱۹۹۶)
امروزه کنترل بیماری بروسلوز بر سه اصل کشتن دام های آلوده،پاستوریزه کردن محصولات لبنی و واکسیناسیون استوار است . واکسیناسیون دام ها برپایه تلقیح سویه های زنده ضعیف شده بروسلاآبورتوس۴۵/۲۰.S19 ) )و بروسلا ملیتنسیس (Rev1) است که استفاده از این واکسن ها در دام با محدودیت هایی همراه است (ویزکاینو و همکاران(۱۹۹۶)؛راجان(۲۰۰۲). همچنین واکسنهای بروسلوز انسانی شامل باکتری غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته با دومشکل اساسی مواجه اند : نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری می نمایند و دوم آ نکه با واکنش های ازدیاد حساسیت ناخواسته همراهند . در همین راستا، در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژن های مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان طبیعی، کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه وبررسی قرارگرفته است (بتس،۱۹۹۳؛باتاچارجی،۲۰۰۲). از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم، لیپوپلی ساکارید به عنوان عامل ویرولانس اصلی (LPS) شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند همچنین LPSبه لحاظ ایمونولوژیک، آنتی ژن اصلی سطح سلولی بروسلا محسوب می شود بتس(۱۹۹۳)؛عباس و همکاران(۱۹۹۷) .به همین دلیل امر وزه استفاده از LPS بروسلا به دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار می گیرد (شریفات و همکاران،۲۰۰۸؛کاروف و همکاران،۱۹۸۴)
۱-۱۱- دیواره ی سلولی باکتری های گرم منفی:
۱-فضای پری پلاسمیک
۲-لیپو پروتئین ها (LP)