– سانتریفیوژ با دور rpm[136]۵۰۰۰ به مدّت min5 و دور ریختن محلول روئی که حاوی Extender بود( به دلیل سفت نبودن رسوب ، با سمپلر محلول روئی به آرامی کشیدهشد).
۳-۲-۲-۲-۲- پروتئینزدایی
۳-۲-۲-۲-۲-۱- ساخت محلولLysis Buffer (c ◦۶۰ )
جدول(۳-۳):موادتشکیل دهنده محلول Lysis Buffer
نام ماده
مقدار مورد نیاز
مرکاپتواتانول
ml 2
TrismM۱۰ (PH=8)
g121/0
NaCl
g58/0
[۱۳۷]EDTAmM۱۰ (PH=8)
g 292/0
SDS[138] ۱%
g 5/0
۳-۲-۲-۲-۲-۲-رسوب دادن پروتئینها
اضافهکردن lµ۴۵۰ از محلول LB(c◦۶۰ )،lµ۵۰ از محلول DTT( M 5/0 ) و lµ۱۰ از آنزیم پروتئیناز K(1- mg.ml20 ) به ویالهای حاوی رسوب سلولهای اسپرم و ورتکس با دستگاه Micro Spin .
قرار دادن ویالها به مدّتh3 روی دستگاه ترمومیکسر با دمای c◦۶۰ و لرزش S20 به ازای هرmin 1 و دور لرزش rpm600 .
ورتکس و اسپین نمونهها پس از اتمام زمان ترمومیکسر .
اضافه کردنlµ ۱۶۰ از محلول NaCl اشباع و تکان دادن شدید ویالها با دست به صورت دورانیبه مدّتmin 2 جهت تسهیل جداسازی پروتئینها .
سانتریفیوژ به مدّتmin 10 با دور rpm 13000و ریختن محلول رویی در ویالهای جدید دارای برچسب و نامگذاری.
۳-۲-۲-۲-۳- جداسازی DNA
میزان اضافه کردنml۱ اتانول مطلق و سرد به محلول هر ویال و به آرامی تکان دادنو آشکار شدن کلاف DNA و قرار دادن ویالها به مدّت min20 در فریزرc ◦۲۰-.
سانتریفیوژ به مدّت min10 با دورrpm 12000 شد و دور ریختن اتانول و جداسازی رسوبDNA .
حل کردن رسوب DNA هر ویال در lµ۸۵ آب فاقد یون[۱۳۹]با عمل پیپتاژِ خیلی آرام و نگهداری در دمای c◦۴.
۳-۲-۲-۲-۴- تعیین غلظت و خلوص DNA استخراجشده
برای ارزیابی غلظت و خلوص DNA،از دو روش استفاده شد:
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۳-۲-۲-۲-۴-۱- استفاده از ژل آگارز
در این روش نمونههای DNAبا غلظتهای متفاوت روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد.ژل بهوسیله اتیدیومبروماید رنگآمیزی شده و تحت نور ماوراء بنفش بررسی گردید.مقدار و کیفیت DNA از روی قطر و جایگاه قرارگیری باند مشخّص شد.
۳-۲-۲-۲-۴-۱-۱- مواد و لوازم
پودر آگارز
بافرTBE [۱۴۰]X )5/0 (
لوازم الکتروفورز (شانه و سینی مخصوص ، تانک الکتروفورز ، دستگاه مولد نیرو )
رنگ بافر بارگزاری[۱۴۱]
سمپلر و سر سمپلر µl 100-10
