شناساگرهای بیکون مولکولی^[۸۸]
یکی دیگر از روش‌های آشکارسازی استفاده از شناساگر‌های بیکون مولکولی (MB) است. این گونه شناساگر‌ها بر اساس یک ساختار سنجاق‌سری^[۸۹] طراحی می‌شوند که دارای یک رنگ گزارشگر فلورسنتی در یک انتها و یک مولکول خاموشگر در انتهای دیگر هستند. ساختار سنجاق‌سر باعث می‌شود شناساگر‌های MB در هنگام هیبرید نشدن به صورت تاخورده^[۹۰] درآید. این حالت باعث می‌شود تا مولکول‌های خاموشگر و گزارشگر در نزدیکی یکدیگر قرار گیرند و سیگنال فلورسانسی تشکیل نشود (و یا در صورت تشکیل بسیار کم باشد). با این وجود هنگامی که شناساگرMB با الگوی خود هیبرید می‌شود،ساختار سنجاق‌سر باز شده و رنگ گزارشگر از مولکول خاموشگر فاصله می‌‌گیرد. در این لحظه دستگاه Real-Time PCR سیگنال فلورسنتی ایجاد شده را شناسایی می‌کند. در این سیستم امکان آنالیز منحی ذوب نیز وجود دارد[۲۶،۱۴،۴].
شکل( ۱-۱۶) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
اینشناساگر قبلازاتصالبه DNA بهصورتلوپاست. بهعلتنزدیکی دو مولکول گزارشگر و خاموشگر،نورساطعشدهتوسط خاموشگرمهارمی­شود. پساتصالشناساگربهمحلموردنظرخود،ساختار سنجاق­سر بازشده،درنتیجهرنگ­هاازهمدورمی­شوندوتابشنورازگزارشگرانجاممی­گیرد.

سیستم شناساگر FRET^[91]
شناساگرهای FRET بر اساس انتقال انرژی از یک رنگ فلورسنتی به رنگ دیگر عمل می‌کنند. دو توالی الیگونوکلئوتیدی اختصاصی مجزا،با رنگ‌های فلورسنت نشاندار می‌شوند. شناساگری که در بالادست^[۹۲] قرار می‌گیرد،در انتهای ۳’ خود یک مولکول دهنده^[۹۳] دارد و شناساگری که در پایین‌دست قرار می‌گیرد دارای یک مولکول پذیرنده^[۹۴] در انتهای ۵’ خود است. پروب‌ها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در فاصله کمی با یکدیگر روی توالی هدف هیبرید شوند. زمانی که شناساگرها هیبرید شدند، مولکول‌های فلورسنتِ دهنده و پذیرنده در نزدیکی هم قرار می‌گیرند. این امر باعث می‌شود که انرژی از فلوروفور دهنده به پذیرنده انتقال یابدو سیگنالی با طول موج متفاوت گسیل شود. سپس کاهش میزان رنگ فلورسانس مولکول دهنده و یا افزایش رنگ فلورسانس پذیرنده توسط دستگاه شناسایی می‌شود. از این رو تنها زمانی که شناساگرها به هم متصل ‌شوند،سیگنال فلورسنتی قابل شناسایی است. در این سیستمآنالیز منحنی ذوب تشکیل می‌شود. از این سیستم در تشخیص ژنوتیپ،شناسایی پلی‌مورفیسم تک‌نوکلئوتیدیو تشخیص دیگر جهشها استفاده می‌شود[۲۶،۱۴،۴].
شکل( ۱-۱۷) : مکانیسم عملشناساگر FRET طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
انتقال انرژی رزونانس در هنگام آزاد بودن شناساگر‌ها بسیار کم است امّا هیبریداسیون شناساگر‌ها منجر به نزدیک شدن فلوروفورهای مولکول دهنده و پذیرنده،و در نهایت افزایش سیگنال می‌شود.

شناساگرهای عقربی^[۹۵]
برخلاف شناساگر‌های دوسویه نشاندار و شناساگرهای MB، مکانیسم شناساگر‌های عقربی درون‌ مولکولی^[۹۶] است. ساختار این شناساگر‌ها شامل یک حلقه سنجاق‌سر متصل به انتهای ۵’ پرایمر و یک مهارکننده PCR^[97] است. بعد از مرحله طویل شدنِ آغازگر،طی واکنش تکثیری،شناساگر اختصاصی قادر خواهد بود به ناحیه مکمل خود (درون رشته مولکول DNA) اتصال یابد. پدیده هیبرید شدن شناساگر با الگو،منجر به باز شدن حلقه سنجاق‌سرمی شود. در نتیجه مولکول فلورسانس از مولکول خاموشگر فاصله گرفته و سیگنال افزایش می‌یابد. شناساگر‌های تک‌مولکولی^[۹۸] از نظر کینتیک (سرعت) مطلوب و کارآ هستند. اتصال دوتایی^[۹۹] (دوگانه) شناساگر به قطعه تکثیریِ^[۱۰۰]هدف،تضمین می‌کند که هر شناساگر دارای یک هدف در آن ناحیه ‌باشد. در این روشبرشآنزیمی وجود ندارد، از این رو زمان لازم برای سیگنال‌دهی کاهش می‌یابد. در عوض شناساگر‌های دوسویه نشاندار بایستی ابتدا به توالی هدف متصل و سپس شکسته شوند تا افزایش سیگنال مشاهده شود. از شناساگرهای عقربی به طور گسترده‌ای در شناسایی و تشخیص جهش استفاده می‌شود. این شناساگر‌ها علاوه بر اختصاصیت و آنالیز منحنی ذوب شناساگر‌های بیکون مولکولی (MB)، سرعت بالایی دارند و بسیار کارآمد هستند[۲۶،۱۴،۴].

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل( ۱-۱۸) : مکانیسم عمل شناساگر عقربی طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
بعد از مرحله طویل شدنِ آغازگر،طی واکنش تکثیری،شناساگر اختصاصی قادر خواهد بود به ناحیه مکمل خود (درون رشته مولکول DNA) اتصال یابد. پدیده هیبرید شدن شناساگر با الگو،منجر به باز شدن حلقه سنجاق‌سرمی شود. در نتیجه مولکول فلورسانس از مولکول خاموشگر فاصله گرفته وسیگنال افزایش می‌یابد.
۱-۵-۴-۲-۵- علاوه بر موارد مذکور،سیستم­های دیگری نیز برای روش دومِ انجام واکنشReal-Time PCR وجود دارد که از توضیح آن­ها در مطالعه حاضر صرف نظر شده­است. این سیستم­ها شامل سیستمتشخیص ژنوتیپ-SNP آمپلی‌فلور، سیستم مستقیم ژنی آمپلی‌فلور^[۱۰۱]، شناساگر ‌های سایه‌افکن^[۱۰۲]و شناساگر های نورانی^[۱۰۳] (درخشان) می­باشد[۱۴].
۱-۵-۵- برخی مفاهیم و اصطلاحات در واکنش Real-Time PCR
۱-۵-۵-۱- منحنی تکثیر^[۱۰۴]
این نمودار،نموداری است که در آن،تعداد چرخه­ها^[۱۰۵] در مقابل شدّت نور فلورسنت رسم می­ شود. این منحنی شامل ۴ فاز است : ۱- فاز خط پایه^[۱۰۶]،۲- فاز نمایی^[۱۰۷]،۳- فاز خطی^[۱۰۸]،۴- فاز پلاتو^[۱۰۹].
فاز خط پایه،فازی است که در آن،واکنش­تکثیر آغاز می­ شود و تا چند چرخه ابتدایی(معمولاً ۱۵-۳ چرخه)،ادامه می­یابد امّا سطح فلورسنت تولیدی در این مرحله برای دستگاه قابل شناسایی نیست. در واقع چرخه­های ابتدایی که در آن­ها شدّت فلورسنت تغییر معناداری نکرده­است و سیگنال قابل قبولی به دستگاه نفرستاده­است. گرچه در این فاز سیگنال تشخیصی دستگاه وجود ندارد امّا تکثیر تصاعدی DNA در حال رخ­دادن است.
فاز نمایی،فازی است که در آن،تکثیرِ تصاعدی در بالاترین میزان خود،انجام می­ شود و اوّلین سیگنال قابل تشخیص برای دستگاه فرستاده می­ شود. طول مدّت این فاز به غلظت نمونه و کیفیت واکنش Real-Time PCR بستگی دارد.
فاز خطی،فازی است که در آن،به علت مصرف واکنش­دهنده­ها مثل پرایمر،dNTP و …،راندمان تکثیر کاهش می­یابد و وارد فاز پلاتو می­ شود.
فاز پلاتو،فازی است که در آن، تولیداتPCRرو به تنزل می­باشند و واکنش به طور ناگهانی برای چرخه­های بعدی،متوقف می­ شود[۲۶،۱۴،۴].
شکل (۱-۱۹) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR
در این منحنی، تعداد چرخه­ها در قبال شدت نور فلورسنت رسم می­ شود. این منحنی شامل ۴ فاز است : اولین فاز،فاز خط پایهاست که واکنش­تکثیر آغاز می­ شود و تا چند چرخه ابتدایی، ادامه می­یابد امّا سطح فلورسنت تولیدی در این مرحله برای دستگاه قابل تشخیص نیست. فاز دوم، فاز نمایی است که در آن تکثیرِ تصاعدی در بالاترین میزان خود، انجام می­ شود و اوّلین سیگنال قابل شناسایی برای دستگاه تولید می­ شود. فاز سوم، فاز خطی است که راندمان تکثیر در آن کاهش می­یابد و علّت این امر مصرف واکنش­دهنده­ها مثل پرایمر،dNTP و … است. فاز چهارم، فاز پلاتو است که در این فاز، تولیداتPCR رو به کاهش می­گذاردوواکنش به طور ناگهانی برای چرخه­های بعدی، متوقف می­ شود.
۱-۵-۵-۲- گزارشگر نرمال­شده(Rn)^[110]
بین چاهک­های دستگاه Real-Time PCR یک­سری نواسانات وجود دارد که ناشی از خطای کاربر در تغییرات غلظت و حجم واکنش یا خطای پردازش دستگاه است. برای تصحیح این نوسانات،نور فلورسنت نرمالایز می­ شود.برای این کار از فاکتوری به نام Rn استفاده می­ شود.
شدّت فلورسنت انتشار یافته توسّط یک رنگ گزارشگر
Rn₌
شدّت فلورسنت انتشار یافته توسّط یک رنگ مرجع خنثی^[۱۱۱]
رایج­ترین رنگ مورد استفاده به­عنوان رنگ مرجع خنثی،رنگ ROX می­باشد. مواد تشکیل­دهنده این رنگ شامل :۵-carboxy-X-rhodamine ,0.1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.6)، می­باشد.[۲۶،۱۴،۴]

شکل (۱-۲۰) : رنگ مرجع خنثی)(ROX
۱-۵-۵-۳- چرخه آستانه (CT)^[112]
به اوّلین چرخه­ای که شدّت نور فلورسنت آن­ به طور معناداری از خط پایه بیشتر است و اوّلین سیگنال قابل تشخیص برای دستگاه است،چرخه آستانه گفته­می­ شود. عدد CT با مقدار الگوی اولیه،رابطه معنی­داری دارد و از روی آن می­توان مقدار نمونه اولیه را تخمین زد.هر چه مقدار الگوی اولیهبیشتر باشد،مقدار CT کم می­ شود. چرا که تعداد مولکول فلورسنت بیشتری در نتیجه سنتز محصول بیشتر،به جهت وجود DNAالگوی بیشتر،در هر چرخه سیگنال تولید می­ کند و واکنش سریع­تر و در چرخه­ای با شماره کمتر به فاز نمایی وارد می­­شود[۲۶،۱۴،۴].

شکل (۱-۲۱) : منحنی تکثیر و نمایش CT
عدد CT با مقدار الگوی اولیه،رابطه معنی­داری دارد. هر چه مقدار الگوی اولیه بیشتر باشد،مقدار CT کم می­ شود. در واقع سطح آستانه که بالاتر از میزان فلورسنت پایه است، موجب مشخص شدن CT در هر منحنی می­گردد. با مقایسه CT دو نمونه می­توان میزان الگوی اولیه آن­ها را مقایسه نمود.
۱-۵-۵-۴- منحنی ذوب^[۱۱۳]
در PCRمعمولی،تعیین اختصاصیت سیگنال­ها(فصل اوّل-فورمت غیر اختصاصی-رنگ­های اینترکاله)،از طریق استفاده از ژل آگارز و ارزیابی وزن مولکولی باند مورد نظر است. در Real-Time PCR،اطمینان از اختصاصی بودن محصول با تعیین درجه دمای ذوب^[۱۱۴]™،صورت می­گیرد.دمای ذوب دمایی است که در آن ۵۰% از مولکول DNA به صورت واسرشت­شده باشد. در واکنش Real-time PCR،پس از اینکه واکنش وارد فاز پلاتو شد،با تنظیمات قبلی،واکنش وارد فاز نمودار ذوب می­ شود تا منحنی ذوب ترسیم و آنالیز گردد. مراحل به این صورت که ابتدا حرارت از دمایی پایین­تر از نقطه ذوب محصولات شروع می­ شود و تا دمایی بالاتر از نقطه ذوب افزایش می­یابد تا رشته­ های DNA،از هم باز می­شوند.اگر مخلوط DNAدو رشته­ای در حضور SYBR-Green به دمای ذوب خود نزدیک شود،کاهش شدیدی در میزان فلورسنت توسط دستگاه ثبت می­ شود. لذا در پایان آزمایش با ذوب محصولات تکثیر شده در حضور رنگ­های اینترکاله،یک یا چند منحنی تشکیل می­ شود. محصولات تکثیرشده در دماهای متفاوتی بر اساس طول قطعه تکثیری و میزان G-C،به نقطه ذوب می­رسند. هنگامی که محصولات،واسرشت شوند،میزان فلورسنت کاهش یافته و توسط دستگاه اندازه ­گیری می­ شود. سپس قلّه­های ذوب^[۱۱۵] را می­توان بررسی کرد. این قلّه­ها معادل باندهای مشاهده­شده در ژل الکتروفورز شده در PCRمعمولی می­باشند. وجود یک قلّه نشانگر اختصاصیت واکنش است امّا بیش از یک قلّه وجود توالی­های غیراختصاصی را نشان می­دهد[۲۶،۱۴،۴].

شکل (۱-۲۲) : منحنی ذوب و Tm
وجود یک قلّه نشانگر اختصاصیت واکنش است امّا بیش از یک قلّه وجود توالی­های غیراختصاصی را نشان می­دهد.
۱-۵-۵-۵- منحنی استاندارد^[۱۱۶]
برای تعیین کیفیت یک آزمایش،رسم منحنی استاندارد لازم و ضروری است. یک منحنی استاندارد برای یک جفت آغازگرِ خاص بوسیله تهیه یک رقّت سریالی از نمونه الگو،بدست می ­آید.برای بدست آوردن رقّت سریالی کافی است غلظت نمونه الگو را با دستگاه نانودراپ اندازه بگیریم و سپس نمونه را با فاکتور رقّت خاص مثل ۵،۱۰،… رقیق کنیم. برای رسم نمودار استاندارد حداقل ۵ نقطه لازم است. بنابراین به ­گونه ­ای رقیق­سازی می­کنیم که در ۵ غلظت متفاوت DNA داشته­باشیم که همه غلظت­ها برای دستگاه قابل خوانش باشند. غلظت­های بالا محدودکننده واکنش و غلظت­های پایین غیر قابل تشخیص برای دستگاه هستند.در اکثر نرم­افزارهافمنحنی استاندارد به صورت نموداری روی محور XY ترسیم می­ شود. در این نمودار لگاریتم رقّت/تعداد نسخه روی محور X و میانگین میزان CT روی محورY قرار دارد.علاوه بر رسم منحنی،بخش نرم­افزاری دستگاه ضرایب r،R²،شیب منحنی و بازده تکثیر را محاسبه نموده که هر یک از این فاکتورها برای ارزیابی کیفیت آزمایش مورد استفاده قرار می­گیرد. تفاوت معنی­دار در بازدهی تکثیر یا ارزش CT در تکرارهای مربوط به یک نمونه،باعث کاهش ارزش r و R² می­ شود. در حالت نرمال و مطلوب آزمایش،۹۹۰۱/۱۰ <r و ۹۸۰/۰ <R² خواهد بود.
بازدهی تکثیر توسط شیب منحنی استاندارد و از طریق فرمول زیر محاسبه می­ شود :
E = 10^-1/slope