آمپول حاوی باکتری فریز شده که پیش از این در فریزری با دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری می شد، مدتی قبل از تلقیح در داخل محفظه بی هوازی و در دمای محیط قرار داده شده تا آب شود. تمام محیطهای کشت استریل شده (جامد و مایع) نیز در داخل محفظه بی هوازی قرار داده شد. سپس گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر به درون محفظه باز گردید، جریان گاز نیتروژن در ابتدا زیاد بود تا موجب بیرون راندن اکسیژن موجود در محفظه شود. پس از گذشت چند دقیقه و خاموش شدن شمعی که برای حصول اطمینان از شرایط بدون اکسیژن در داخل محفظه روشن شده بود، جریان نیتروژن کاهش داده شد اما تا انتهای فرایند تلقیح، جریان مداوم نیتروژن به درون محفظه بی هوازی وجود داشت.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
حدود ۶-۵ میلی لیتر از محیط کشت توسط سرنگ در داخل یک لوله استریل ریخته شد و سپس تمام محتویات آمپول به این محیط کشت اضافه شد. بدین ترتیب، سوسپانسونی از سلولها حاصل گردید که به عنوان مایه تلقیح برای تلقیح کردن محیطهای کشت مورد استفاده قرار گرفت. برای تلقیح کردن محیط کشت جامد، چند قطره از سوسپانسیون سلولی توسط لوپ[۲۴۰] روی محیط کشت آگار قرار داده شد و سپس درِ لوله های کشت بسته شد. برای تلقیح محیط کشت مایع، مقداری از سوسپانسون سلولی توسط سرنگ استریل کشیده شد و از طریق درپوش لاستیکی سرم باتل، داخل محیط کشت مایع ریخته شد. تمامی لوله های کشت و سرم باتل ها در داخل انکوباتور (Stuart، انگلستان) در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پیش از آن، درِ لوله های کشت و اطراف پتری دیش با پارافیلم پیچیده شد تا مانع از نفوذ هوا به داخل لوله ها شود. پس از آنکه کدورت کافی در محیطهای کشت مشاهده گردید و رشد برفکی[۲۴۱] روی پلیت آگار پدیدار شد، نمونه ها به یخچال منتقل شده و به عنوان کشت اصلی در دمای ۰/۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند. باکتری رشد داده شده روی پلیت آگار در تصویر ۳-۴ نشان داده شده است. تصویر ۳-۵ رشد باکتری لانگالی را در محیط کشت مایع در مقایسه با محیط کشت تلقیح نشده نشان می دهد.
تصویر ۳‑۴: باکتری لانگالی رشد داده شده روی پلیت آگار
تصویر ۳‑۵: باکتری رشد کرده در محیط کشت مایع (سرم باتل سمت راست) و محیط کشت تازه بدون باکتری (سرم باتل سمت چپ)
آزمایشهای ناپیوسته[۲۴۲] کشت لانگالی
در آزمایشهای ناپیوسته کشت باکتری لانگالی که در سرم باتل انجام شد تاثیر پارامترهای مختلفی همچون نوع سوبسترای آلی، غلظت سوبسترای آلی، فشار گاز سنتز داخل سرم باتل، نوع و میزان عوامل کاهنده و pH اولیه محیط کشت روی رشد سلول، میزان مصرف سوبسترا و تولید محصول بررسی گردید.
رشد باکتری با سوبسترای آلی
در مطالعات اولیه ای که تنر[۲۴۳] و همکارانش هنگام جداسازی باکتری کلستریدیوم لانگالی از محیطهای طبیعی انجام دادند، امکان رشد باکتری را با حدود ۳۰ سوبسترای آلی بررسی کردند [۴۶]. هرچند، در آن بررسی اولیه تنها امکان رشد و یا عدم رشد باکتری با هر یک از سوبستراهای آلی گزارش گردید و هیچ مطالعه ای روی دانسیته سلولی و یا تولید محصول با هر کدام از سوبستراها انجام نگرفت. به منظور بررسی رفتار باکتری در مواجه با سوبستراهای آلی مختلف در محیط کشت، تاثیر چهار سوبسترای آلی در محیط کشت باکتری مورد بررسی قرار گرفت.
تاثیر نوع سوبسترای آلی
به منظور مطالعه تاثیر سوبسترای آلی روی رشد لانگالی، از چهار سوبسترای آلی فروکتوز، گلوکز، استات و اتانول در آزمایشهای جداگانه استفاده گردید. بدین منظور محیطهای کشت (بدون منبع کربنی و عوامل کاهنده) در سرم باتل (۵۰ میلی لیتر محیط کشت در باتل ۱۶۳ میلی لیتری) تهیه و استریل شد. محلولهای ۰/۵ گرم بر لیتر فروکتوز، گلوکز، اتانول و استات نیز به صورت جداگانه و با حفظ شرایط بی هوازی در چهار سرم باتل تهیه و استریل گردیدند. پس از آن، سوبسترای آلی و عوامل کاهنده به محیط کشت اصلی اضافه گردیده و pH محیط کشت حدود ۹/۵ تنظیم شد. برای تنظیم pH محیط کشت در سرم باتل در بسته استریل، مقادیر مشخص و از پیش تعیین شده ای از اسید هیدروکلریک یا هیدروکسید سدیم ۰/۱ مولار استریل توسط سرنگ به محیطها اضافه گردیدند. برای خواندن pH محیط کشت در سرم باتل، از کاغذ pH متر (Whatman) که برای محدوده ۷/۶-۲/۵=pH بود استفاده می شد. به منظور حصول اطمینان از شرایط کاملا بی هوازی، مجددا گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر به درون باتل ها فرستاده شد. سپس همه محیطهای کشت با ۵/۲ میلی لیتر از سلولهای در حال رشد باکتری لانگالی (باکتری در حال رشد روی فروکتوز) تلقیح شدند. همه باتل ها به صورت افقی در داخل شیکر انکوباتور[۲۴۴] (innova40، انگلستان) در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و دور ۱۵۰(rpm) قرار داده شدند. در فواصل زمانی مشخص، از باتل ها به وسیله سرنگ استریل ۵/۲ میلی لیتر نمونه برداشته می شد که برای تعیین دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و غلظت محصول مورد آنالیز قرار می گرفتند. آزمایشهای ناپیوسته در یک دوره ۱۲۰ ساعته (۵ روزه) انجام شد و برای اطمینان از صحت نتایج به دست آمده، آزمایشها ۳ بار تکرار گردیدند.
تاثیر غلظت سوبسترای آلی
نتایج حاصل از بررسی تاثیر سوبسترای آلی روی فرایند رشد و تولید محصول نشان داد که فروکتوز بهترین سوبسترای آلی بود. برای مطالعه تاثیر غلظت فروکتوز روی فرایند تخمیر، غلظت فروکتوز در محیط کشت از ۰/۱ تا ۰/۱۱ گرم بر لیتر تغییر داده شد و سایر مراحل همانند آزمایش قبل تکرار گردیدند. این آزمایشها نیز در یک بازه زمانی ۱۲۰ ساعته انجام شد و از محیطهای کشت در فواصل زمانی معین برای بررسی رشد سلول، مصرف فروکتوز و تولید محصول نمونه برداری گردید.
رشد باکتری با گاز سنتز
همان طور که قبلا اشاره شد باکتری لانگالی می تواند COو H2/CO2 را که اجزای اصلی گاز سنتز محسوب می شوند به عنوان منبع کربنی مصرف کرده و محصول تولید کند. به منظور بررسی فرایند تخمیر گاز سنتز به اتانول و استات توسط لانگالی، آزمایشهای ناپیوسته در سرم باتل بدون حضور هرگونه سوبسترای آلی (جامد یا مایع) در محیط کشت انجام شد. برای انجام این آزمایشها، از کپسولی حاوی مخلوطی از گازهای CO، H2، CO2 و Ar با درصد حجمی ثابت ۳۰، ۳۰، ۳۰ و ۱۰% (Wellgas، مالزی) استفاده گردید. گاز آرگون به عنوان استاندارد داخلی[۲۴۵] برای محاسبه تغییرات فشار کل در داخل باتل به کار گرفته شد و استفاده از این گاز بی اثر تاثیری روی توانایی سلولها برای تولید محصول نداشت.
برای انجام آزمایشهای ناپیوسته با گاز سنتز، محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) پس از آماده سازی استریل شد. سپس عامل کاهنده استریل شده به محیط کشت اضافه گردیده و pH محیط کشت روی ۹/۵ تنظیم گردید. گاز سنتز پس از عبور از فیلتر از طریق سوزن (سرسرنگ) وارد باتل گردید و از سوزن دیگری برای خروج گاز از داخل باتل استفاده شد. مرحله افزودن گاز به محیط کشت به دلیل سمیت بالای گاز CO لزوما در محفظه بی هوازی انجام می گرفت. سایر مراحل تلقیح، انکوباسیون و نمونه برداری همانند آزمایشهای قبل انجام می گرفت.
تاثیر همزمان عوامل کاهنده و PH اولیه محیط کشت
سیستئین اسیدی و سدیم سولفید دو عامل کاهنده ای هستند که عموما برای محیط رشد باکتریهای استوژنیک توسط ATCC و DSMZ[246] توصیه می شوند [۱۴]. تعیین غلظت بهینه این عوامل کاهنده برای اطمینان از اینکه سطح مطلوبی از پتانسیل کاهشی در محیط رشد ایجاد شده است اهمیت زیادی دارد. علاوه بر عوامل کاهنده، pH محیط کشت نیز پارامتر مهمی در تنظیم جریان کربن و الکترون در داخل دیواره سلولی است. pH محیط کشت می تواند متابولیزم سوبسترا را تنظیم کرده و پارامترهای فیزیولوژیکی نظیر pH درون سلولی، پتانسیل غشاء و نیروی محرکه پرتونی[۲۴۷] را تغییر دهد [۹۸]. به منظور بررسی تاثیر همزمان عوامل کاهنده و pH محیط کشت روی عملکرد سلولها و بازده تولید محصول، آزمایشهای تخمیر ناپیوسته گاز سنتز با تغییر عوامل کاهنده و به طور همزمان pH محیط کشت انجام گرفت.
محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) در چند سرم باتل تهیه و استریل شد. سپس غلظتهای مختلفی از محلولهای کاهنده مطابق جدول ۳-۲ به محیطهای کشت اضافه گردید و pH محیط کشت در ۹/۵ یا ۸/۶ تنظیم شد. سپس گاز سنتز پس از عبور از فیلتر برای مدت ۰/۱ دقیقه وارد باتل شده و از خروجی خارج شد و در نهایت با برداشتن سوزن خروجی، فشار گاز سنتز در داخل باتل ها به ۲۰۰ کیلوپاسکال رسانده شد. برای تلقیح محیطهای کشت، از سلولهایی استفاده گردید که از بیوراکتور گرفته شدند. برای داشتن سلولهایی که از نظر متابولیکی بسیار فعال بوده، به گاز سنتز عادت کرده و بتوانند آن را به سرعت مصرف کنند، فرایند تخمیر گاز سنتز در بیوراکتور انجام گرفت. ترکیب محیط کشت در بیوراکتور عینا مشابه سرم باتل بود و از جریان مداوم گاز سنتز با ترکیب ذکر شده به عنوان سوبسترا استفاده گردید که در ادامه توضیح داده خواهد شد. پس از تلقیح محیطهای کشت، باتل ها در شیکر انکوباتور قرار داده شدند. همانند آزمایشهای قبل، نمونه گیری از محیطهای کشت جهت انجام آنالیزهای مربوطه در فواصل زمانی معین انجام گرفت. طول مدت این سری از آزمایشهای ناپیوسته ۳۶ ساعت بود. برای اطمینان از صحت نتایج به دست آمده، آزمایشها ۳ بار تکرار گردیدند.
جدول ۳‑۲: محیطهای کشت مختلف برای بررسی تاثیر همزمان عوامل کاهنده و pH محیط کشت
شماره محیط کشت
عامل کاهنده (مول بر لیتر)
عنوان عامل کاهنده
pH اولیه محیط کشت
۱
سیستئین اسیدی (۰۷/۵)
RAI
۹/۵
۲
سیستئین اسیدی (۸۲/۳) و سدیم سولفید (۸۳/۰)
RAII
۹/۵
۳
سیستئین اسیدی (۵۳/۲) و سدیم سولفید (۶۷/۱)
RAIII
۹/۵
۴
سیستئین اسیدی (۰۷/۵)
RAI
۸/۶
