۳
۳-۵-۵-۲-رقیق سازی پرایمرها:
طبق دستور العمل شرکت سازنده برای رقیق سازی هر کدام از پرایمرها طبق فرمول زیر عمل شد:
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
N1v1=N2V2 ۱۰۰(PM) × X=10 (Pm) × ۱۰۰(µL) → ۲۰(µl)
ابتدا پرایمرهای موجود برای ژن های اختصاصی برای همه ژن های ویرولانس (که به صورت لیوفیلیزه بودند) طبق دستورالعمل ارسال شده از طرف شرکت پیشگام تا غلظت Pmol/ µl100 با آب مقطر دوبار استریل رقیق شده و به عنوان استوک برای نگهداری طولانی مدت در فریزر۲۰- درجه منتقل شد و محلول کاری با اضافه کردن µl 90 آب مقطر به µl 10 محلول استوک فراهم شد.
۳-۵-۶- pcr
۳-۵-۶-۱-بهینه سازی اجزاء واکنش PCR
واکنش pcr در شرایط توصیه شده توسط سایر محققین در دستگاه مستر سایکلر اپندورف گرادیانت طبق جدول زیر انجام گردید، اجزا و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش pcr برای تمامی ۶ ژن یکسان می باشد (جدول شماره ۳-۲)
جدول ۳-۲: اجزاء و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش pcr
اجزای واکنش
غلظت
حجم(میکرولیتر)
مستر میکسAmpliqon واجد Taq DNA polymerase به همراه بافر) dNTP (2X وکلرید منیزیم
X2
۱۰
پرایمر فوروارد
۱۰ پیکومول/ میکرولیتر
۱
پرایمر ریورس
۱۰ پیکومول/ میکرولیتر
۱
ژنوم
–
۱
آب مقطر آمپولی استریل
–
۷
حجم نهایی
–
۲۰
۳-۵-۶-۲-بهینه سازی تهیه Master Mix
در ابتدا بدون تهیه رقت از پرایمرها مستر میکس تهیه شد و به طور تصادفی از ژنوم استخراج شده شماره ۲۳، PCR انجام شد که پس از مراحل الکتروفورز و رنگ آمیزی تجمع پرایمر محسوس بود. سپس با تهیه رقت از پرایمر طی چند مرحله، در نهایت رقت ۲۰(pm) و حجم ۲(µl) بدست آمد، که با انجام PCR جواب های قابل قبولی حاصل شد.
۳-۵-۷- گرادیانت دمایی جهت بدست آوردن دمای اتصال برای ژن aer
در ابتدا قبل از شروع pcr برای بدست آوردن دمای اتصال گرادیانت دمایی انجام گردید، نمونه مورد نظر برای این کار نمونه شماره ۲۳ انتخاب گردید، دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی به ترتیب عبارتند از ۶۹-۶۸-۶۷-۶۶ با هر دو پرایمر فوروارد و ریورس، سپس الکتروفورز انجام گردید و بعد از مشاهده باندها تصمیم گرفته شد که از دمای ۶۸ درجه در ژن aer استفاده شود چون وضوح باند در هر دو پرایمر فوروارد و ریورس در این دما بیشتر بود. برنامه دمایی مورد استفاده برای یک واکنش pcr برای ژن aer در( جدول شماره ۳-۳) آمده است.
جدول ۳-۳: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن aer
