Aspiration medium
H-TCM
۱۰۰ IU/ml heparin
۱۰% FBS
در مرحله‌ی بعد زیر استریومیکروسکوپ اقدام به جداسازی تخمک‌های با کیفیت مطلوب (تخمک‌های با حداقل سه لایه سلول کومولوس متراکم و سیتوپلاسم گرانوله یکنواخت) نموده و سپس این تخمک‌ها به قطره شستشو انتقال داده می‌شوند و ۴ بار درون قطرههای ۳۰۰ میکرولیتری محیط شستشوی اووسیت شستشو داده میشدند.
COC washing medium
H-TCM
%۱۰FBS
۳-۱-۲- بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM)
تخمک‌ها بعد از ۴ بار شستشو به قطرات ۵۰ میکرولیتری محیط بلوغ منتقل (۱۰تخمک در هر قطره) و در انکوباتور ۹ درصد CO₂، با دمای ۳۹ درجه سانتی‌گراد و رطوبت حداکثر برای مدت ۲۴-۲۲ ساعت به منظور انجام روند بلوغ آزمایشگاهی انکوبه می‌شوند.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

Maturation medium
B-TCM 199
۱۰%FBS
۰٫۱ IU/ml FSH
۳-۱-۳- لقاح در شرایط آزمایشگاهی (IVF)
۳-۱-۳-۱- آماده سازی تخمکهای بالغ شده برای لقاح
پتریدیش مربوط به کشت تخمک ها، ۲۴ ساعت پس از کشت، از انکوباتور خارج و توسط استریومیکروسکوپ بررسی میشد. پراکندگی سلولهای کومولوس معیار بلوغ موفق در نظر گرفته میشد. برای آماده سازی تخمکهای بالغ شده جهت انجام IVF، تخمکها از پتریدیش بلوغ به قطرههای ۳۰۰ میکرولیتری محیط لقاح منتقل و با جابهجایی قطره به قطره آنها، شستشو انجام میشد. سپس تعداد ۱۰ عدد اووسیت بالغ به هر قطره ۵۰ میکرولیتری از محیط لقاح منتقل و تا زمان آماده شدن اسپرم درون انکوباتور نگهداری میشد.
Washing medium
Rinsing TALP
۱۰ μl/ml Na Pyrovate stock
۶ mg/ml BSA-Fraction V
۳-۱-۳-۲- آماده سازی اسپرم
در این پژوهش از اسپرم منجمد شده قوچ نژاد شال برای لقاح آزمایشگاهی استفاده شد. پایوتهای اسپرم از ازت خارج و در آب گرم با دمای ۳۷ درجهسانتیگراد در مدت ۱ دقیقه یخ گشایی میشدند. پس از ضدعفونی
پایوت ها با پنبه آغشته به مقدار اندک الکل، محتوای هر پایوت جداگانه درون میکروتیوبهای استریل ml 1.5 تخلیه و پس از ارزیابی میزان تحریک اسپرم، پایوتهای نامرغوب حذف میشد و سپس محتوی سایر میکروتیوبها باهم ادغام میشد. برای جداسازی اسپرمهای مرغوب، درون یک لوله فالکون ۱۵ میلی لیتری ۷۰۰ میکرولیتر پرکول ۹۰ درصد و سپس به آرامی ۷۰۰ میکرولیتر نیز پرکول ۴۰ درصد روی آن قرار داده میشد (سیلیکای کلوئیدی پوشیده با پلی وینیل پیرولیدون (PVP. سپس حداکثر ۳۵۰ میکرولیتر از اسپرم (سیمن) نیز به آرامی روی پرکول گذاشته و با دور g 700 برای مدت ۸ دقیقه سانتریفیوژ میشد. پس از اتمام سانتریفیوژ، پلت تشکیل شده به درون میکروتیوپ منتقل و پس از ارزیابی تحرک اسپرمها در زیر استریومیکروسکوپ، اسپرم هایی با تحرک بالا از پلت تشکیل شده، به هر قطره از مدیای لقاح، ۱۰۰۰۰- ۵۰۰۰ اسپرم به ازای هر تخمک اضافه می‌گردد. پتریدیشهای لقاح برای مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۹ درجه، ۸ درصد CO₂ و رطوبت بالای ۹۵ درصد، قرار داده میشدند.
Fertilization TALP
۱۰ μl/ml Na Pyrovate stock
۶ mg/ml BSA-Fraction V
۱۰ μg/ml Heparine
۳-۱-۴- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل ازIVF
حدود ۱۸ الی ۲۰ ساعت پس از انجام IVF، دیش لقاح از انکوباتور خارج و به منظور جداسازی اسپرمها و سلولهای کومولوس از زایگوتها، برای مدت ۳۰ ثانیه ورتکس و جنین‌ها بعد از ۴ بار شستشو در محیط H-SOF-BSA، به محیط کشت منتقل و در انکوباتور ۹ درصد CO₂، با دمای ۳۹ درجه سانتیگراد و رطوبت حداکثر انکوبه می شدند.
Washing medium
HEPES SOF
۵ mg/ml BSA-Fraction V
Culture media (OCM-SOF)
b-SOF or IVC SOF
۳-۱-۵- تازه کردن^[۹۸]محیط کشت جنین‌ها
تازه کردن محیط کشت جنین ها به طور معمول هر ۴۸ ساعت انجام می‌گیرد (روزهای ۳ و ۵) که دفعه اول آن (روز ۳) جهت جداکردن جنین های تسهیم شده از تسهیم نشده انجام می‌گیرد. ذکر این نکته ضروری است که قطرات IVM، IVF، IVCو refresh حداقل ۲ ساعت قبل از استفاده در انکوباتور قرار داده شوند.
۳-۲- تهیه محلول‌های انجمادی
تمامی محیط‌های مرتبط با روند انجماد شیشه ای در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری می شوند.
الف) محیط پایه:
محیطی که به عنوان محیط پایه در تولید تمامی محیط‌های مورد نیاز در انجماد شیشه‌ای در این مطالعه استفاده می شود، یک محیط بافری به نام PB1 است که برای ساخت آن به محیط PBS^[99] فاقد کلسیم ومنیزیم مقدار ۳/۳ میلی مول گلوکز، ۳۳/۰ میلی مول سدیم پیروات، ۱۰۰ واحد بین المللی به ازای هر میلی لیتر پنی‌سیلین و ۲۰ درصد FCS افزوده گردیده و پس از فیلتر کردن با فیلترهای۲۲/۰میکرومتری تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگه‌داری می‌گردد.
لازم به ذکر است زمانی که از این محیط در ساخت محلول های انجمادی و ذوب استفاده می‌شود، بایستی سرم مورد نیاز بعد از افزودن تمامی ترکیبات و در آخرین مرحله اضافه گردد.
Handling Medium (HM): H-TCM supplemented with 20% FCS
ب) محیط های انجماد:
– محیط تعدیل کننده اول
(V₁):10%EG +10%DMSO dissolved in HM
– محیط تعدیل کننده دوم
(V2): 20%EG+20%DMSO dissolved in HM
گفته شده است هر چه این محیط ها کهنه تر باشند، کارآمدتر خواهند بود.
۳-۳- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای
تخمکهایی که در محیط IVM در انکوباتور گذاشته شدهاند حدود ۲ ساعت بعد از انکوباتور برداشته شده و در محیط شستشو (HM) حدود یک دقیقه قرار داده میشود و بعد به محیط V1 انتقال میدهیم و ۳۰ ثانیه در این محیط میماند و بعد به محیط V2 انتقال داده و در این محیط نیز ۳۰ ثانیه میماند و بعد بر روی کرایوتاپ گذاشته و سریع به ازت مایع انتقال داده میشود.
۳-۴- محیط ذوب
الف) Warming1(W1): HM supplemented with 1/25M Sucrose.