۳-۲-عصاره گیری
۳-۲-۱-تهیه عصاره متانولی
مقدار یک گرم برگ آسیاب شده وزن و به درون ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس با اضافه کردن متانول ۱۰۰ درصد حجم محلول به ۳۰ میلی لیتر رسانده شد. درب ارلن بوسیله ی فویل بسته شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق بر روی shaker قرار داده شد. پس از آن عصاره توسط کاغذ صافی واتمن شماره ی ۱ صاف شد. برای بررسی پتانسیل آنتی اکسیدانی، غلظتهای مختلفی از این استوک (stock) اصلی تهیه گردید.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۲-۲-تهیه عصاره آبی
مقدار یک گرم برگ آسیاب شده وزن و به درون ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس با اضافه کردن آب مقطر حجم محلول به ۳۰ میلی لیتر رسانده شد. درب ارلن بوسیله ی فویل بسته شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق بر روی shaker قرار داده شد. بعد از گذشت ۲۴ ساعت محلول هموژنه بدست آمده با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. مایع فوقانی به عنوان استوک (stock) اصلی جدا شد که با افزودن آب مقطر غلظت های مختلفی از آن تهیه گردید.
۳-۳-تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی با بهره گرفتن از روش DPPH
در این روش، آنتی اکسیدان ها با رادیکال آزاد DPPH واکنش داده و آن را کم رنگ یا بی رنگ می کنند که مقدار کاهش رنگ با پتانسیل آنتی اکسیدانی نمونه رابطه مستقیمی دارد. تعیین پتانسیل آنتی اکسیدنی با بهره گرفتن از رادیکال آزاد DPPH بر طبق روش توصیف شده توسط Shimada و همکاران (۱۹۹۲) انجام گرفت.
۳-۳-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر، متانول ۱۰۰ درصد، محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول و محلول استاندارد Trolox استفاده گردید.
۳-۳-۲-روش آزمایش
به منظور اندازه گیری پتانسیل آنتی اکسیدنی عصاره های متانولی برگ گیاهان از محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول استفاده گردید. ابتدا محلول استوک (stock solution) DPPH در متانول بدین صورت تهیه گردید که ۲۴ میلی گرم از پودر رادیکال DPPH توزین و در یک ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس ۱۰۰ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد به آن اضافه گردید. محلول حاصل تا زمان استفاده در دمای °C20- نگاهداری شد. برای تهیه محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول، ۱۰ میلی لیتر از محلول استوک را در یک ارلن فویل پیچ شده ریخته و ۴۵ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد به آن اضافه گردید. محدوده جذب این محلول در طول موجnm 515 می بایست ۰۲/۰ ± ۱/۱ باشد. در آزمایش-های انجام شده، ۲۸۵۰ میکرولیتر از محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول به درون هر شیشه ریخته شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر به آن اضافه گردید و به مدت یک ساعت در تاریکی قرار داده شدند. غلظت های مختلف عصاره متانولی با اضافه کردن حجم های مختلف متانول ۱۰۰ درصد به عصاره متانولی اصلی که در قسمت ( ۳-۲-۱ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره بود و فقط محتوی ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد و ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول بود. دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول۱۰۰ درصد در طول موجnm 515 صفر گردید و پس از آن جذب محلول های شاهد و نمونه ها در طول موج مذکور قرائت شد. در این آزمایش از غلظت های صفر، ۴/۰، ۸/۰، ۲/۱، ۶/۱، ۲، ۴/۲، ۸/۲ و ۲/۳ میلی گرم در میلی لیتر عصاره ی گیاهی استفاده شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استفاده شد.
۳-۳-۳-تهیه محلول استاندارد
برای تعین پتانسیل آنتی اکسیدانی لازم است منحنی استاندارد رسم گردد. برای این منظور از ترولکس (Trolox) که یک آنتی اکسیدان سنتزی و دارای ساختمانی شبیه به ویتامین E میباشد استفاده گردید. ابتدا محلول استاک (stock solution) 1000 میکرومولار ترولکس در متانول بدین صورت تهیه گردید که ۰۰۱/۰گرم پودر ترولکس در ۴ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد حل گردید. با اضافه کردن حجم های مختلف متانول۱۰۰ درصد به این محلول غلظت های صفر، ۲۵، ۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰، ۴۰۰، ۵۰۰، ۶۰۰، ۷۰۰، ۸۰۰ و ۹۰۰میکرومولار ترولکس در متانول تهیه گردید. آنگاه ۱۵۰ میکرولیتر از غلظت های تهیه شده به ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰ درصد DPPH در متانول اضافه گردید. ظرف های شیشه ای حاوی محلول هایی با غلظت های مختلف ترولکس در ۰۰۴/۰ درصدDPPH ، به مدت یک ساعت در تاریکی قرار گرفتند. محلول شاهد (کنترل) فاقد ترولکس بود و فقط محتوی ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد و ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول بود. پس از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول ۱۰۰ درصد در طول موجnm 515، جذب محلول های استاندارد در این طول موج قرائت شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد.
با بهره گرفتن از منحنی استاندارد پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ گیاه مورد نظر معادل ترولکس برحسب میکرومول ترولکس بازاء گرم وزن خشک تعیین گردید.
به منظور تعیین غلظتی از عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر که ۵۰ درصد رادیکال های DPPH را مهار می کند(IC₅₀)، از نمودارهای مربوط به جذب محلول DPPH در غلظت های مختلف عصاره متانولی هر نمونه گیاهی استفاده گردید.
همچنین درصد مهار رادیکال های DPPH توسط نمونه های گیاهی با بهره گرفتن از فرمول زیر تعیین گردید:
% Inhibition = ( A_blank – A_sample ) / A_blank × ۱۰۰
A_blank =میزان جذب کنترل
A_sample =میزان جذب نمونه
۳-۴-اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu
بررسی میزان ترکیبات فنلی کل با بهره گرفتن از Folin-Ciocalteu طبق روش Kim و همکاران (۲۰۰۵) از طریق کاربرد عصاره متانولی برگ گیاهان به صورت زیر انجام گرفت:
۳-۴-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از عصاره های متانولی برگ گیاه مورد نظر، متانول ۱۰۰ درصد، متانول ۵۰ درصد، معرف Folin-Ciocalteu، محلول بی کربنات سدیم ۶ درصد و محلول استاندارد گالیک اسید استفاده گردید.
۳-۴-۲-روش آزمایش
به منظور اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل در عصاره های متانولی برگ گیاهان، از معرف رقیق شده Folin-Ciocalteu استفاده گردید. بدین صورت که درون یک ظرف فویل پیچ شده ۵ میلی لیتر معرف Folin-Ciocalteu ریخته و ۴۵ میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. در نتیجه معرف Folin-Ciocalteu 10 بار رقیق تر شد. این محلول تا زمان استفاده در یخچال نگاهداری شد. به درون هر شیشه ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu ریخته شد. سپس ۲۰۰ میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر به آن اضافه گردید و به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند. غلظت های مختلف عصاره متانولی با اضافه کردن حجم های مختلف متانول ۱۰۰ درصد به عصاره متانولی اصلی که در قسمت ( ۳-۲-۱ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. سپس ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد (W:V) بی کربنات سدیم، که از طریق حل نمودن ۶ گرم بی کربنات سدیم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه شده بود، به لوله های آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۹۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره بود و فقط محتوی ۲۰۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد، ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu و ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی کربنات سدیم بود. جذب دستگاه اسپکتروفتومتر توسط محلول شاهد (کنترل) در طول موجnm 750 صفر گردید و پس از آن جذب محلول های تیمار تهیه شده در طول موج مذکور قرائت شد. در این آزمایش از غلظت های صفر، ۱، ۲، ۳، ۴، ۵، ۶، ۷، ۸، ۹ و ۱۰ میلی گرم در میلی لیتر عصاره-ی گیاهی استفاده شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استفاده شد.
۳-۴-۳-تهیه محلول استاندارد
برای اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل لازم است منحنی استاندارد رسم گردد. برای این منظور از گالیک اسید استفاده شد. محلول استوک (stock solution) 200 میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید بدین ترتیب تهیه شد که ۲ میلی گرم گالیک اسید در ۱۰ میلی لیتر متانول ۵۰ درصد حل گردید. با اضافه کردن حجم های مختلف متانول۱۰۰ درصد به این محلول غلظت-های صفر، ۲۰، ۴۰، ۶۰، ۸۰، ۱۰۰، ۱۲۰، ۱۴۰، ۱۶۰ و ۱۸۰میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید تهیه گردید. آنگاه ۲۰۰ میکرولیتر از غلظت های تهیه شده به لوله های آزمایش محتوی ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند و پس از آن ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی کربنات سدیم به هر لوله آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۹۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
محلول شاهد (کنترل) فاقد گالیک اسید بود و فقط محتوی ۲۰۰ میکرولیتر متانول ۵۰ درصد، ۱۵۰۰ میکرو لیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu و ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی-کربنات سدیم بود که توسط آن جذب دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موجnm 750 صفر گردید. پس از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر جذب محلول های استاندارد در طول موج مذکور قرائت شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد.
سپس با بهره گرفتن از منحنی استاندارد میزان ترکیبات فنلی کل موجود در برگ گیاه مورد نظر بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک محاسبه گردید.
۳-۵-بررسی ترکیبات اسانس برگ گیاه برگ بو
۳-۵-۱-اسانس گیری
به منظور تهیه اسانس مقدار ۱۰۰ گرم برگ خرد شده توزین و در فلاسک دستگاه تقطیر (کلونجر) قرار داده شد. سپس به آن ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه گردید. فلاسک اسانس گیری پس از آماده شدن بر روی گرم کن برقی قرار داده شد. برای جلوگیری از مخلوط شدن آب و اسانس یک میلی لیتر حلال پنتان در مجرای ذخیره اسانس ریخته شد. با گرم شدن دستگاه، اسانس موجود در برگ همراه آب تبخیر شده به مبرد رسیده و در اثر سرد شدن، بخار آب و اسانس هر دو به حالت مایع در آمده که اسانس در حلال پنتان حل شده ولی آب به علت داشتن چگالی بیشتر از پنتان عبور کرده وارد فلاسک می گردد تا چرخه دوباره تکرار شود. مدت زمان اسانس گیری دو ساعت در نظر گرفته شد. اسانس استخراج شده به شیشه های کوچک درب دار منتقل و اطراف هر شیشه با کاغذ آلومینیومی پوشانده شد و تا زمان انجام آزمایش ها در یخچال نگاهداری شد. در این مرحله بازده تولید اسانس، با تقسیم وزن اسانس بر وزن پودر برگ استفاده شده در اسانس گیری تعیین گردید.
۳-۵-۲-آزمایش های مربوط به تعیین ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو
از روش کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی (GC/MS) جهت شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو استفاده گردید.
۳-۵-۲-۱-معرفی دستگاه کروماتوگراف گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS)
از دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی Agilent Technologies مدل C5975 استفاده شد که ستون آن HP-5MS به طول ۳۰ متر و قطر داخلی ۲۵/ ۰میلی متر و ضخامت لایه فاز ساکن در آن ۲۵/۰میکرومتر بود. از گاز هلیوم با فشار ورودی یک میلی لیتر در دقیقه به عنوان گاز حامل استفاده شد. درجه حرارت ستون بین ۶۰ تا °C 210 برنامه ریزی شد و به تدریج در هر دقیقه °C3 به حرارت افزوده شد. سپس افزایش دما تا°C 240 با سرعت°C 20 در دقیقه انجام گرفت و به مدت ۵/۸ دقیقه در دمای نهایی نگه داشته شد. درجه حرارت آشکارساز °C280 و دمای محفظه تزریق نیز °C 280 بود. انرژی یونیزاسیون برابر۷۰ الکترون ولت بوده است. محدوده جرمی از ۵۰ تا ۴۸۰ بوده است.
پس از تزریق اسانسها به دستگاه گاز کروماتوگراف متصل شده با طیف سنج جرمی (GC/MS) نهایت طیفهای جرمی و کروماتوگرام های مربوطه ترسیم شدند. سپس با بهره گرفتن از زمان بازداری، شاخص بازداری، مقایسه طیف های جرمی با ترکیب های استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود، ترکیب های تشکیل دهنده اسانس ها مورد شناسایی کمی و کیفی قرار گرفت.
۳-۶-بررسی پتانسیل آللوپاتی عصاره آبی گیاه برگ بو
۳-۶-۱-اثر عصاره آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید برگ گیاهچه های گندم و شاهی
۳-۶-۱-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از برگ گیاهچه های ۲۰ روزه، عصاره آبی برگ شاخه غنچه دار گیاه برگ بو، آب مقطر، محلول هیپوکلرید سدیم ۲۰% و استون ۸۰ درصد استفاده گردید.
۳-۶-۱-۲-آماده سازی گیاهان
جهت جلوگیری از رشد قارچ ها ابتدا بذرها در محلول هیپوکلرید سدیم ۲۰% به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده شدند. سپس چند بار با آب معمولی و سرانجام با آب مقطر شسته شدند.
از ظروف کشت به ابعاد ۵ × ۱۴× ۱۸ این آزمایش استفاده شد. ابتدا کف ظروف با مقداری پرلیت پر شد. سپس بذرها بطور کاملا یکنواخت روی پرلیت ها پخش شدند و بار دیگر لایه نازکی از پرلیت روی بذرها ریخته شد. آبیاری با آب مقطر بصورت روزانه و در حد نیاز انجام گرفته شد.
غلظت های ۱۰%، ۲۵% و ۵۰% عصاره آبی برگ شاخه غنچه دار گیاه برگ بو با اضافه کردن حجم های مختلف آب مقطر به عصاره آبی اصلی که طرز تهیه آن در قسمت ( ۳-۲-۲ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. پس از جوانه زدن بذرها و بزرگ شدن گیاهچه ها، از روز دهم ۵۰ میلی لیتر عصاره با غلظت های تعیین شده برای هر ظرف، به صورت روزانه به پای ریشه گیاهچه ها تزریق شد و در روز بیستم جهت اندازه گیری مقدار کلروفیل و کاروتنوئید جمع آوری شدند. برای ظرف شاهد نیز فقط از آب مقطر استفاده شد. برای هر غلظت ۳ تکرار در نظر گرفته شد و جمع آوری گیاهچه ها جهت اندازه گیری مقدار کلروفیل و کاروتنوئید به صورت طرح کاملا تصادفی صورت پذیرفت.
۳-۶-۱-۳-روش آزمایش
۲۰۰ میلی گرم از بافت تر برگ توزین و در هاون چینی قرار داده شد. پس از افزودن مقداری استون ۸۰ درصد، قطعات برگ کاملا ساییده شدند. محلول حاصل به درون فالکون ریخته شد و حجم آن با استون ۸۰ درصد به ۲۵ میلی لیتر رسانده شد. محلول حاصل با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ شد. از محلول فوقانی برای اندازه گیری کلروفیل و کاروتنوئید استفاده گردید. بدین ترتیب که جذب محلول تهیه شده، توسط دستگاه اسپکتروفتومتر شیمادزو مدل UV-160A که با استون ۸۰ درصد تنظیم شده بود، در طول موج هایnm ۶۴۵ وnm ۶۶۳ برای کلروفیل[Arnon, 1967] و در طول موج هایnm ۴۱۲، nm431،nm 460 وnm 480 برای کاروتنوئید خوانده شد. میانگین مقادیر جذب بدست آمده طبق طول موج های مربوطه در فرمول های زیر به ترتیب برای محاسبه میزان کلروفیل و کاروتنوئید قرار داده شد:
= ۲۰.۲ (A₆₄₅) + 8.02 (A₆₆₃) × v / f.w. × ۱۰۰۰ (mg/g .f.w) chl.
v =حجم نهایی محلول بر حسب میلی لیتر
f.w. =وزن تر بافت بر حسب میلی گرم
= A جذب اندازه گیری شده در طول موج های نوشته شده
Carotenoids (mg/ml) =