۱-۱۱-۲- مواجهات شغلی
تحقیقات نشان داده که مواجهات شغلی می تواند به طور مستقیم یا غیر مستقیم روی نتایج IVF تاثیر گذارد. آلودگی های محیطی از جمله آلودگی هوا و آلودگی هایی که توسط کارخانجات تولید شده است، منجر به تولید مواد و محصولات اکسیداتیو فعال می شود که از آن جمله می توان به افزایش فلزات سنگین مانند سرب، آرسنیک و جیوه یا آلاینده های کشاورزی مانند سموم اشاره کرد. بنابراین ، این آلودگی ها می توانند بر نتایج IVF تاثیر گذارند(Gate, Paul, Ba, Tew, & Tapiero, 1999).

از عوامل دیگر می توان به استرس های دمایی اشاره کرد. دمای بیضه به طور معمول کمتر از دمای بدن است، شرایط شغلی مانند نانوایی، رانندگی و مانند این می تواند باعث استرس گرمایی شود. بنابراین ، این امر منجر به از دست رفتن سلول های جنسی و کاهش اسپرم و نیز کاهش سلامت DNA و نقص بسته بندی کروماتین و سقط زودرس جنین شود(Banks, King, Irvine, & Saunders, 2005; Zhu & Setchell, 2004).
۱-۱۱-۳- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی
شیمی درمانی و رادیوترپی باعث افزایش آسیب DNA اسپرم می شود. در این بیماران علاوه بر افزایش میزان آسیب DNA به علت شیمی درمانی، آندوکرینی بیضه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به آزواسپرمی می شود. در این بیماران انجماد اسپرم پیشنهاد می گردد(Howell & Shalet, 2005).
۱-۱۱-۴- سن
از دیگر عواملی که می تواند بر قطعه قطعه شدن DNA اثر گذارد ، سن است. تحقیقات نشان داده است که در افراد مسن میزان قطعه قطعه شدن DNA و سقط های خود به خودی افزایش می یابد(Kleinhaus, et al., 2006).
۱-۱۲- تکنیک­های بررسی ساختار کروماتین
میزان موفقیت تکنیک باروری به سلامت کامل تخمک و اسپرم وابسته است. در دهه ۱۹۸۰ و ۱۹۹۰ میلادی تحقیقات زیادی در زمینه لقاح و تحریک تخمک­گذاری به انجام رسید، ولی در مردان فقط به وجود اسپرم اشاره شد و تحقیقات زیادی در مورد سلامت و عملکرد آن صورت نگرفت.
با پیشرفت تکنیک ICSI^[62] نقش اسپرم در تکامل و تکوین جنین مشخص شد. تحقیقات زیاد در این راستا منجر به بررسی تست­های عملکردی اسپرم و ارتباط آنها با باروری شده است. وضعیت کروماتین اسپرم از جمله مباحثی است که بیشتر به آن پرداخته شده، زیرا اسپرم نه تنها در فعال­سازی تخمک مؤثر است، بلکه نیمی از ژنوم نسل آینده توسط اسپرم منتقل می­ شود و سلامت آن، جهت تکوین جنینی اهمیت بالایی دارد. در این میان بررسی سلامت DNA اسپرم از اهمیت خاصی برخوردار است که از دلیل اهمیت آن می­توان به موارد زیر اشاره کرد:
۱)وجود رابطه معکوس بین پارامترهای اسپرم و آسیب DNA
۲) افزایش آسیب DNA در افراد نابارور
۳)‌ وجود رابطه معکوس بین میزان لقاح و آسیب DNA
۴) افزایش سقط در بیماران با آسیب DNA بالا.
لذا، با توجه به اهمیت سلامت DNA اسپرم در باروری در این قسمت به روش­های بررسی ساختار کروماتین پرداخته می­ شود.
۱-۱۲-۱- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان
صرف نظر از نحوه ایجاد آسیب در DNA، روش­های متفاوتی جهت تشخیص میزان این آسیب­ها وجود دارد. برای ارزیابی آسیب DNA اسپرم دو روش مختلف در نظر گرفته شده است:
۱)روشی که شکستگی­های DNA را هم به صورت تک رشته یا دو رشته تعیین می­ کنند. روش TUNELاست و، لازم به ذکر است که شکستگی در DNA حساسیت DNA را به دناتوره شدن افزایش می­دهد.
۲) روش­هایی که سلامت کروماتین اسپرم را با اندازه ­گیری حساسیت کروماتین و مخصوصاً DNA نسبت به دناتوره شدن تحت تیمارهای خاص ارزیابی می­ کند. مانند SCSA، ^[۶۳]CMA3، ^[۶۴]DBD-FISH، Comet و ^[۶۵]SCD. تست­های دیگری نیز برای ارزیابی کروماتین اسپرم وجود دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.
۱-۱۲-۱-۱- تست TUNEL
این روش در ابتدا برای تشخیص جمعیت اسپرم­های دچار آپوپتوز در نمونه­های انزالی به کار برده شد. در این روش شکست­ها در یک یا دو رشته DNA قابل تشخیص است. در این روش نوکلئوتیدهای نشاندار شده، نوکلئوتیدهای انتهایی رشته DNA شکسته شده را مورد هدف قرار می­ دهند. این واکنش توسط یک پایانه ترانسفرازی کاتالیز می­ شود که دی اکسید یوریدین تغییر یافته را با بیوتین یا Digoxigenin در پایانه OH 3′ از رشته­ای که شکسته شده، ترکیب می­ کند. سپس نوکلئوتیدهای تغییر یافته توسط آنتی بادی فلور سنت نمایان می­شوند. نوکلئوتید مستقیماً با فلئوکروم نشاندار می­ شود. جهت تشخیص فلورسنت در اسپرم­ها می­توان از میکروسکوپ فلورسنت یا از دستگاه فلوسایتومتری استفاده کرد. رنگ فلورسنت مشاهده شده در هر اسپرم، نشانگر شکستگی در رشته یا رشته­ های DNA است(EI, et al., 2007) .
۱-۱۲-۱-۲- روش DBD-FISH
این روش که زمان زیادی از ابداع آن نمی­گذرد بیشتر در فعالیت­های تحقیقاتی کاربرد دارد. جهت تشخیص و بررسی میزان شکستگی­ها در DNA اسپرم ابتدا ساختار DNA را با تغییر غلظت PH دناتوره کرده و سپس با مواد قلیایی باعث جدا شدن محل­های شکسته شده از یکدیگر در ساختار DNA می­ شود. پس از دناتوره شدن و خارج شدن پروتئین­ها با بهره گرفتن از محلول لیز کننده، تک­رشته­ های شکسته شده با پروب DNA هیبرید می­شوند. با بهره گرفتن از این روش می­توان میزان شکستگی DNA را به صورت شاخص DNA fragmentation بیان کرد. همانند روش قبل، این روش جهت استفاده کلینیکی مناسب نیست. همچنین این روش تنها روشی است که ارزیابی آسیب را، سلول به سلول، در جایگاهی از توالی خاص DNA انجام می­دهد(Fernández & Gosálvez, 2002).
۱-۱۲-۱-۳- روش Comet
یکی دیگر از روش­های مفید جهت بررسی آسیب DNA در یک یا دو رشته آن، روش Comet است. پیش از این برای انجام این روش از شرایط بافری خنثی برای شکستگی­های دو رشته DNA استفاده می­شد. سپس با کمی تغییرات از بافر الکتروفورز قلیایی جهت بالا بردن حساسیت DNA یک و دو رشته­ای نسبت به شکستگی­ها استفاده شد. با بهره گرفتن از این روش می­توان علاوه بر تشخیص انواع مختلف فراگمنتاسیون DNA، مانند نکروز و آپوپتوز، میزان شکستگی­ها را نیز تشخیص داد. اساس این تکنیک شناسایی شکستگی­ها در یک یا دو رشته DNA با بهره گرفتن از دستگاه الکتروفورز است(Duty, et al., 2002).
۱-۱۲-۱-۴- رنگ­آمیزی CMA3
کرومومایسین A3(CMA3) به عنوان یک رنگ فلورسنت در تحقیقات سیتو ژنتیک استفاده می­ شود. با بهره گرفتن از این رنگ­آمیزی می­توان به صورت غیر مستقیم ساختار کروماتین را مورد بررسی قرار داد. این ترکیب جهت اتصال به شیار بزرگ در ساختار DNA با مولکول پروتامین رقابت می­ کند. بنابراین، این تکنیک مشخص کننده نقص در بسته­بندی کروماتین (کمبود پروتامین)، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته است. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که ارتباط معنی­داری بین کمبود پروتامین بررسی شده به روش رنگ­آمیزی CMA3 در اسپرم و میزان لقاح در بیماران کاندیدا ICSI و IVF وجود دارد(Iranpour, Nasr-Esfahani, Valojerdi, & Taki Al-Taraihi, 2000).

شکل ۱-۲- ارزیابی آسیب DNA توسط: A.TUNEL, B.COMET, C.CMA3
۱-۱۲-۱-۵- تکنیک SCSA
اساس این روش وجود حساسیت ساختار کروماتین و DNA هنگام مواجه با اسید و ویژگی­های متا کروماتیک آکریدین اورانژ است. این فلوروکروم به عنوان یک منومر بین دو زنجیره DNA قرار می­گیرد و زمانی که DNA طبیعی است رنگ سبز و زمانی که فلوروکروم با تک رشته­ای DNA ترکیب شود، رنگ قرمز-نارنجی از خود ساطع می­ کند. اسپرم­های رنگ گرفته توسط فلوسایتومتری مشخص می­شوند. محققان در مطالعات بالینی بیشتر از این روش استفاده می­ کنند، با به کارگیری این روش می­توان میزان موفقیت باروری را در افراد مشخص کرد(Evenson, Larson, & Jost, 2002).
۱-۱۲-۱-۶- تست SCD
یکی دیگر از روش­هایی که اخیراً جهت بررسی آسیب DNA اسپرم به کار گرفته شده است، روش پراکندگی کروماتین اسپرم^[۶۶] است که اساس آن شبیه تکنیک SCSA و بر اساس مستعد بودن شکستی­های DNA جهت تخریب در هنگام مواجه با اسید است. وجود آسیب در DNA اسپرم با بهره گرفتن از وجود هاله­های کروماتین خارج شده از تراکم در اطراف هسته اسپرم تشخیص داده می­ شود. از مزایای این روش، آسان، مقرون به صرفه و حساس بودن است. هر چند نتایج کلینیکی این تکنیک مورد بررسی قرار نگرفته ولی به نظر می­رسد که می­توان از آن به صورت معمول در آزمایشگاه­های آندرولوژی استفاده کرد(Fernandez, et al., 2003).
شکل۱-۳- تست SCD
۱-۱۲-۱-۷- رنگ­آمیزی آکریدین اورانژ
استفاده از رنگ متا کروم آکریدین اورانژ یکی دیگر از روش­های بررسی آسیب DNA اسپرم است. اساس این تکنیک مانند SCSA است. مشکل اساسی این تکنیک متغیر بودن مشاهده­گر برای تشخیص رنگ فلورسنت بین سبز و نارنجی است که احتمالاً یک سری رنگ­های حد واسط با یک حساسیت متفاوت برای دناتوره شدن اسپرم وجود دارد(Nasr-Esfahani, Razavi, & Mardani, 2001) .
۱-۱۲-۱-۸- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو
تولوئیدین بلو یک رنگ متا کروم مرتبط با هسته اسپرم و کروماتین آن است. این رنگ پس از اتصال به کروماتین غنی از هیستون سرشار از لیزین، بنفش پررنگ می­ شود. در صورتی که اگر به کروماتین غنی از پروتامین اتصال یابد آبی کمرنگ می­گردد. این رنگ­آمیزی جهت بررسی میزان بلوغ هسته و تراکم کروماتین به کار می­رود. این تست ساده، کم هزینه و با میکروسکوپ­های معمولی قابل اجراست(Krzanowska, 1982) .
۱-۱۳- روش مهاجرت اسپرم^[۶۷]
این روش قدیمی­ترین روش جداسازی اسپرم است که به طور معمول مورد استفاده قرار می­گیرد. تکنیک اولیه­ که توسط ماهادوان و بیکر(Mahadevan & Baker, 1984) در سال ۱۹۸۴ شرح داده شد، هنوز هم به طور گسترده­ای در آزمایشگاه­های IVF کاربرد دارد. استفاده از این تکنیک در بیمارانی با پارامترهای اسپرمی نامناسب محدودیت دارد، اما برای افرادی با اسپرم طبیعی، روش استاندارد و قابل اعتمادی است(Henkel & Schill, 2003). اساس روش Swim up بر پایه حرکت فعال و پیشرونده اسپرم از رسوب اسپرم به قسمت فوقانی محیط شستشو است. در این روش بیشتر از ۹۰ درصد اسپرم­های جدا شده حرکت داشته و از لحاظ مورفولوژی، طبیعی­تر از نمونه قبل از شستشو است. همچنین در میان اسپرم­های جدا شده، سلول­های دیگر مانند سلول­های زاینده و گلبول­های سفید وجود ندارد. بازده این روش، وابسته به حرکت اسپرم­ها در مایع منی است(Henkel & Schill, 2003) ولی نتیجه به دست آمده به تعداد آزمایشگاه­ها متفاوت است، چرا که در نتیجه این روش ، عواملی مانند دفعات سانتریفیوژ، نوع محیط کشت مورد استفاده، زمان انکوباسیون و . . . دخالت دارد.
۱-۱۴- روش سانتریفیوژ شیب غلظت^[۶۸]
در این روش، جداسازی اسپرم­ها بر اساس جرم حجمی آنها در هنگام سانتریفیوژ صورت می­گیرد. ابتدا ۲ لایه مجزا از هم با غلظت متفاوت از ماده جدا کننده (Gradient) را در لوله­های مخصوص تهیه کرده و سپس منی مایع شده بر لایه­ های Gradient قرار می­گیرد. این لایه­ های گرادیانت از دانه­ های سیلیس پوشیده شده با PVP یا مولکول­های دیگر با نام­های تجاری متفاوت مانند پرکول، پیور اسپرم، و … تهیه می­ شود. با انجام سانتریفیوژ اسپرم­های زنده که دارای جرم حجمی بیشتری هستند (نسبت به اسپرم مرده) با سرعت بیشتری به طرف انتهای لوله حرکت می­ کنند. در صورتی که سلول­هایی مانند سلول­های زاینده، گلبول­های سفید و باکتری که جرم حجمی کمتری دارند، آهسته­تر حرکت کرده و ما بین لایه­ های فوقانی قرار می­گیرند. با رعایت سرعت و دور چرخش سانتریفیوژ، می­توان به راحتی اسپرم­های زنده، دارای جرم حجمی بالا و اسپرم­های بالغ را از اسپرم­های مرده و یا دیگر سلول­ها جداسازی کرد. خلوص شیمیایی و کیفیت لایه­ های به کار رفته در این روش می ­تواند بر ساختار اسپرم تأثیر مثبت یا منفی بگذارد(Henkel & Schill2003).
فصل دوم
مواد و روش ها
۲-۱-مواد و وسایل مورد نیاز
۲-۱-۱-وسایل مورد نیاز
۱-هود بهداد، ایران
۲-هود کلاس دو Luminar Flow
۳-انکوباتور(CO₂ ۵%، ۳۷ درجه سانتی گراد، رطوبت ۹۵%) Memmert، آلمان
۴-انکوباتور (۳۷ درجه سانتی گراد) بهداد، ایران
۵-میکروسکوپ نوری Olympus، ژاپن
۶-ترازو با دقت۰۰۰۱/۰ گرم Scaltec، سوئد
۷-MAKLER COUNTING CHAMBER
۸-سمپلر ۱۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۱۰۰۰ میکرولیتر Barand، آلمان
۹-دستگاه شمارش سلول (سل کانتر)
۱۰-تایمر دقیق