Hib26
۱
۲
۲
همان طور که در نمودار بالا مشخص است، اگر تعداد کپی جایگاه rpoB را معادل ۱ در نظر بگیریم در تمامی نمونه ها تعداد کپی جایگاه های IS1016 و capB بیشتر است و در برخی نمونه ها به ۳ یا ۴ برابر می رسد.
بر اساس نتایج، دو سویه ۲ و ۳ سه کپی از توالی capb و چهار کپی از توالی IS1016 را داشتند، در حالی که نمونه شماره ۱۴ دو کپی از capb و سه کپی از IS1016 را نشان داد. با توجه به این که در نمونه های ۶ و ۲۶ نسبت۱:۲:۲ در capb، IS1016 به rpoB مشاهده شد . این امر می تواند احتمالا ناشی از حذف شدگی در ژن bexA در این نمونه ها باشد.
در مطالعه حاضر، ارتباط مستقیم بین تعداد کپی جایگاه cap و میزان تولید پلی ساکارید در نمونه های Hib در این مطالعه نشان داده شد. بالاترین مقدار پلی ساکارید توسط Hib2و hib3 گزارش شد که هیچ حذف شدگی در ژن bexA در آن ها وجود نداشت.
شکل ۴-۵: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb در نمونه های انتخاب شده را نشان می دهد. این مدل ها طوری طراحی شده اند که با نتایج حاصل از کمیت سنجی مطلق مطابقت داشته باشند
۴-۵: نتایج تعیین ژنوتیپ:
بر طبق نتایج به دست آمده از PCR 5 نمونه انتخاب شده هر ۵ نمونه متعلق به ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. یعنی در واکنش با ست پرایمر K محصول معادل ۴۵۰ باز تولید کرده و در واکنش با ست پرایمر L محصولی ساخته نشد.
۵۰۰
۱۰۰۰
۱۰۰
۵۰۰
۱۰۰
۱۰۰۰
۲ ۳ ۶ ۱۴ ۲۶ N
۱۰۰
۴۵۰ bp
شکل۴-۶: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها: ست پرایمر K و L
ردیف بالا نشان دهنده محصول ست پرایمر K (ژنوتیپ I) و ردیف پایین نشان دهنده محصول ست پرایمر L (ژنوتیپ II)
فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری
۵-۱: بحث و نتیجه گیری
واکسن هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال ۱۹۸۵ در آمریکا تولید و مورد تایید و استفاده قرار گرفت و نتایج بسیار موفقیت آمیزی در کاهش مرگ و میر ناشی از مننژیت در کودکان نشان داد. از همین رو به دلیل مرگ و میر بالای ناشی از این باکتری، برنامه واکسیناسیون در کشورهای مختلف در دستور کار قرار گرفت، به طوری که طبق آخرین گزارش WHO تا سال ۲۰۱۲ ،برنامه واکسیناسیون در ۱۸۰ کشور دنیا انجام شده و در ۴ کشور دیگر در حال انجام است.
متاسفانه ایران از معدود کشورهایی در جهان است که واکسیناسیون کودکان بر علیه این بیماری هنوز در آن اجرا نشده است.
با توجه به اهمیت این موضوع و با توجه به تحریم های پیش رو برای واردات واکسن، تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفلونزا از اهمیت بالایی برخوردار است. شناسایی یک سویه مناسب بومی برای تهیه واکسن از مهمترین اولویت های تهیه و تولید این واکسن می باشد.
با توجه به این که تا کنون در کشور تلاشی در زمینه آنالیز مولکولی ژنوم تولید کننده PRP صورت نگرفته است، نتیجه این تحقیق می تواند با شناسایی سویه واکسینال بومی مسیر پیش رو برای تولید واکسن بومی و خودکفایی در تولید آن را هموار کند.
تولید پلی ساکارید کپسولی (PRP) این باکتری تحت کنترل ژن های تولید کننده و ترشح کننده آن است که در منطقه ای به نام جایگاه cap تجمع یافته اند. این جایگاه ۱۸kb در Hib متشکل از ۱۰ ژن است که دو بار یا بیشتر در ژنوم باکتری تکرار شده است. دراین مطالعه از تکنیک Real-time PCR جهت مشخص کردن تعداد کپی این جایگاه استفاده شد.
مطالعات در مورد تعداد کپی جایگاه cap قبلا در کشور های دیگر انجام شده است. برای مثال در مطالعه ای که توسط corn و همکاران در سال ۱۹۹۳ انجام شد سویه ای با ۵ کپی از این جایگاه شناسایی شد که حدود ۶ برابر تولید PRP بالاتری نسبت به سویه های فقط دارای ۲ کپی داشت (۱۰۵).
مطالعه جدیدتری که توسط cerquetti و همکاران در سال ۲۰۰۶ انجام شد منجر به گزارش سویه ای با ۶ کپی از این جایگاه شد (۱۹). با این حال نتیجه به دست آمده از سویه های بومی نشان دهنده حداکثر ۳ کپی بوده اند.
همان طور که پیش بینی می شد سویه های Hib2 و Hib3 که میزان تولید PRP بیشتری را نشان داده بودند تعداد کپی بیشتری از منطقه cap نسبت به نمونه های دیگر داشتند. به طوری که در این دو نمونه تعداد ۳ کپی از این جایگاه مشاهده شد.
کمترین میزان PRP در سویه های Hib6 وHib26 مشاهده شده بود. با توجه به دارا بودن دو کپی cap در این سویه ها و وجود حذف شدگی در یکی از نسخه ها، این نتیجه قابل توجیه و تفسیر است.
سویه Hib14 با دارا بودن ۳ کپی از منطقه IS1016 و ۲ کپی از cap ، دارای دو کپی مشابه (بدون حذف شدگی) از جایگاه cap بوده و نتایج اندازه گیری PRP نیز صحت این ادعا را تایید می کند به طوری که تولید PRP در این سویه کمتر از نمونه های Hib2,Hib3 و بیشتر از سویه های Hib6,Hib26 اندازه گیری شد.
مطالعات انجام شده در کشورهای دیگر اغلب به روش ساترن بلات انجام شده و تنها نشان دهنده تعداد کپی جایگاه cap هستند. یافته های حاصل از این روش اطلاعات زیادی در مورد ساختار و نحوه قرار گیری این کپی ها به دست نمی دهد. همچنین این روش هزینه و زمان زیادی می طلبد. در مطالعه حاضر ما از روش جدیدتر و دقیق تر Real-time PCR استفاده کردیم که دقت بسیار بالایی داشته و سرعت دست یابی به اطلاعات در آن بالاتر می باشد.. همچنین این روش با هزینه نسبتا کم و تغییرات اندک قابل اجرا بر روی سروتایپ های دیگر هموفیلوس آنفلونزا می باشد.
روش Real-time PCR برای تعیین تعداد دقیق کپی جایگاه cap توسط Ohkusu و همکاران در سال ۲۰۰۵، بر روی تیپ a هموفیلوس آنفلونزا (Hia) شرح داده شده است (۵۷). با تغییر یک ست پرایمر اختصاصی Hib و طراحی پرایمری برای تهیه منحنی استاندارد آن، از این پروتکل برای تعیین تعداد کپی جایگاه cap در Hib استفاده شد.
سه منطقه بر روی ژنوم برای بررسی در نظر گرفته شده و پرایمرها برای این مناطق طراحی شد. منطقه IS10116 که یک قطعه ۷۱۱bp متصل به جایگاه cap بوده و نسخه های cap را از هم جدا می کند، منطقه capB که تعداد کپی آن ارتباط مستقیمی با میزان تولید کپسول دارد و ژن rpoB که یک ژن خانه دار تک کپی بوده و به عنوان کنترل استفاده می شود.
نتایج به دست آمده از این روش علاوه بر نشان دادن تعداد کپی جایگاه cap، تعداد کپی قطعه IS1016 را نیز نشان می دهد. این موضوع از آن جهت مورد اهمیت است که در بیشتر سویه های Hib یک حذف شدگی در یکی از نسخه های cap وجود دارد، به این صورت که قطعه IS1016 به همراه بخشی از ژن مجاور خود (bexA) حذف شده و بدین ترتیپ یکی از نسخ های cap معمولا ناقص است. به نظر می رسد این حذف شدگی در نسخه های دارای دوکپی از cap مزیتی در جهت حفظ پایداری ژنتیکی در سویه های Hib می باشد(۳۴).
بررسی ها نشان می دهد که این حذف شدگی با جلوگیری از نوترکیبی همولوگ[۷۰] بین نسخه های cap باعث حفظ توان تولید و ترشح کپسول می شود.
از بین سویه های منتخب، سویه Hib6 و Hib26 با دارا بودن دو نسخه cap و دو نسخه از IS1016 واجد این حذف شدگی تشخیص داده شدند.
اگر چه هر دو روش کمی سنجی نسبی و مطلق در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت ، با این حال روش مطلق به دلیل نشان دادن تعداد دقیق کپی مناطق مورد نظر، روش مناسب تری برای هدف ما بود.
