بطور معمول از رنگی فلورسنتی به نام اتیدیوم بروماید استفاده می­ شود. این ماده دارای عامل درج شونده بین بازهای DNA می­باشد. وقتی در معرض امواج ماورای بنفش قرار می­گیرد، اثر فلورسنتی خود را بروز داده و هر چه میزان DNA بیشتر باشد، اثر فلورسنتی و میزان طیف رنگی بیشتر خواهد بود.
۳-۱۲-۸-روش انجام الکتروفورز:
درصد آگارز بکار رفته بسته به اندازۀ DNA و عملی که قرار است انجام شود، متفاوت است. در این تحقیق از ژل آگارز ۸/۰% برای مشاهده محصولات PCR در Gel Dock و از ژل ۱% برای Clean up و تخلیص آنها استفاده شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۱۲-۹-روش تهیۀ ژل آگارز به ترتیب زیر است:
۱- قالب ژل (کاست) با طول و عرض مناسب بسته به تعداد نمونه­ها انتخاب و با چسب مسدود و آماده می­ شود.
۲- برای ایجاد چاهک­ها شانه­هایی با دندانه­های مناسب انتخاب و داخل قالب قرار می­گیرد، به طوری که دندانه­های شانه اندکی با سطح قالب فاصله داشته باشد.
۳-حجم ژل مورد استفاده با توجه به اندازۀ قالب و قطر ژل مورد نظر تهیه می­ شود. به طوری که؛ پودر آگارز پس از توزین، در مقدار مناسبی ۱X)) TBE حل شده و سه دقیقه جوشانده می­ شود .
۴- پس از اینکه دمای محلول آگارز به حدود ۵۵ درجه رسید، به ازای هر ۱۰ میلی­لیتر ژل یک میکرولیتر میکروگرم /ml)1-5/0) اتیدیوم بروماید اضافه و پس از مخلوط شدن در داخل قالب ریخته می­ شود.
۵- پس از اینکه ژل بطور کامل بسته شد، شانه را خارج و ژل در داخل تانک الکتروفورز قرار می­گیرد.
۶- برای هر چاهک ۲ میکرولیتر رنگ بارگذاری با ۴-۳ میکرولیتر از نمونۀ DNA در روی چسب شیشه ­ای تمیز پیپتاژ و کاملاً مخلوط می­ شود و سپس به آرامی داخل چاهک­ها قرار می­گیرند .
۷- بافرتانک (TBE-1X) باید کاملاً روی ژل را بگیرد. تانک الکتروفورز به منبع تغذیه متصل شده و ولتاژ آن در حدود ۸۰-۷۰ ولت تنظیم می­ شود.
۸- وقتی رنگ نشانه، سه چهارم طول ژل را طی کرد، ژل از تانک خارج و در دستگاه Gel-Documentation با نورUV نتیجه مشاهده و عکس­برداری می­گردد.
۳-۱۲-۱۰-خالص سازی محصولات PCR
هریک از محصولات PCR باید تخلیص شوند تا برای مراحل بعدی آماده شوند، بنابراین قطعات تولید شده با بهره گرفتن از کیت­های Fermentas وBioneer تخلیص شدند که این پروسه اصطلاحاً Clean up نام دارد. به این منظور ژل ۱% (۱ گرم آگارز درcc 100 بافر TBE ) تهیه می­ شود، و کل محصول PCR در چاهک ­ها بارگذاری می­شوند و بعد از مشاهده در Gel dock، در روی دستگاه ترانسیلومینیتور^[۶۳] قطعاتDNA از روی ژل بریده و در تیوب­های ۵/۱ میلی­لیتری قرار می­گیرند. سپس طی پروسه­های ذیل با بهره گرفتن از کیتهای ذکر شده و پروتوکل مربوطه، تخلیص می­گردند:
-با کیت Fermentas
۱- به هر تیوب ۵۰۰ میکرولیتر بافر اتصال(Binding Buffer ) افزوده می­ شود.
۲- به هر یک ۵۰ میکرولیتر بافر تبدیل (Converted Buffer) افزوده و مخلوط می­شوند.
۳- تیوب­ها ۳ تا ۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجۀ بن ماری قرار می­گیرند، تا ژل به طور کامل آب شود.
۴- به هر تیوب ۱۰ میکرولیتر سیلیکا افزوده می­گردد.
۵- مخلوط ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار گرفته و هر ۲ دقیقه یکبار مخلوط می­ شود تا سیلیکا ته نشین نشود.
۶- تیوب­ها یک دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­گردند.
۷- مایع رویی خالی و سپس به هر یک ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو(Washing Buffer) افزوده می­ شود.
۸- تیوب­ها یک دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­گردند.
۹- مایع رویی خالی و دوباره به هر یک ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو افزوده می­ شود.
۱۰- تیوب­ها یک دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­گردند.
۱۱- مایع رویی تخلیه و تیوب­ها به صورت در باز، زیر لامپ به مدت۳۰ دقیقه کاملاً خشک می­شوند.
۱۲-۳۰ میکرولیتر بافر TE (Tris-EDTA) اضافه، سوسپانسیون شده،۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجۀ بن ماری قرار می­گیرند.
۱۳- تیوب­ها یک دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­گردند.
۱۴- مایع رویی از ذرات ته نشین شدۀ سیلیکا جدا و به تیوپ­های استریل منتقل می­ شود.
– با کیت Bioneer
۱- ۵ برابر وزن ژل بافر ۱ به هر تیوب افزوده می­گردد.
۲- ۱۰دقیقه در دمای ۶۰ درجۀ سلسیوس بن ماری قرار گرفته و هر ۲-۳ دقیقه یک بار تیوب­ها ورتکس می­شوند.
۳- پس از حل شدن کامل ژل، مواد به ستون فیلتردار منتقل و یک دقیقه در۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ و محلول عبور کرده از فیلتر دور ریخته می­ شود.
۴- به ستون۵۰۰ میکرولیتر بافر ۲ یا بافر شستشو افزوده و یک دقیقه در۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ و محلول عبور کرده از فیلتر دور ریخته می­ شود.تکرار مرحلۀ ۴
۵- یک دقیقه در۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ به منظور حذف اتانول باقیمانده و خشک شدن فیلتر.
۶- ستون فیلتردار به یک تیوب ۵/۱ میلی لیتری منتقل می­گردد.
۷- به ستون۳۰ میکرولیتر بافر ۳ یا بافر جداسازی (Elution Buffer) افزوده،۱دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس۱دقیقه در۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­ شود.
نکات مهم
۱- اتیدیوم بروماید ماده­ای موتاژن است، لذا در هنگام ساخت محلول­ها و تهیۀ ژل، استفاده از دستکش برای جلوگیری از تماس مواد شیمیایی و خطرناک با دست الزامی است.
۲- در استفاده از دستگاه ژل داک که با نور UV کار می­ کند احتیاط لازم رعایت شود.
۳- هنگام بریدن ژل در روی ترانسیلومینیتور از عینک محافظ و دستکش­های مخصوص استفاده شود.
۳-۱۲-۱۱-تعیین توالی
در نهایت برای تأیید صحت ژن تکثیر شده، قطعات به همراه پرایمر F1 برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران ارسال گردیدند.
۳-۱۳-روش تجزیه و تحلیل داده ­ها:
آنالیز داده ­ها با روش­های آمار توصیفی صورت گرفته و در قالب جداول و نمودار­های توزیع فراوانی ارائه می­گردند.
۳-۱۴-ملاحظات اخلاقی:
رعایت اصول معاهده اخلاقی هلسینکی در تمام مراحل کار مدنظر قرار گرفت.
۳-۱۵-مشکلات ومحدویت­ها:
تهیه نمونه­های بالینی
مشکلات کارکردی ابزاری