آب پنیر

بتالاکتوگلوبولین
آلفالاکتالبومین
پروتئزپپتون
آلبومین سرم گاوی
ایمونوگلوبولین

۴-۲
۵/۱-۱
۸/۱-۶/۰
۴/۰-۱/۰
۱-۶/۰

۹
۴
۴
۲
۱

پروتئین‌های آب پنیر دناتوره^[۳۰] نشده را می‌توان از آب پنیر با صاف کردن بسیار دقیق^[۳۱]، کروماتوگرافی تعویض یونی^[۳۲] و یا کروماتوگرافی ژل-فیلتراسیون^[۳۳] جداسازی کرد و به عنوان پروتئین‌های مغذی به فروش رساند(Mattarella, 1983 ).
این پروتئین‌ها داری خواص متفاوتی هستند برای مثال آلفالاکتالبومین که یکی از پروتئین‌های مهم آب پنیر است دارای pH ایزوالکتریک بین ۶/۴ تا ۲/۴ می‌باشد و به شدت در آب محلول است که از این خاصیت برای جداسازی آن استفاده می‌شود (Kamau, Cheison et al. ۲۰۱۰). این پروتئین که به خوبی ویژگی یابی شده است به عنوان یک تنظیم کننده فعالیت آنزیم گالاگتوزیل ترانسفراز^[۳۴] در سنتز لاکتوز^[۳۵] فعالیت دارد(Kim, Baum et al. ۱۹۹۷). آلفالاکتالبومین مرگ سلولی برنامه ریزی شده^[۳۶] را در سلول‌های سرطانی القاء می‌کند (Håkansson, Zhivotovsky et al. ۱۹۹۵, Svensson, Sabharwal et al. ۱۹۹۹) و از طرفی انواع تاخورده^[۳۷] متنوع آن درای فعالیت ضد میکروبی^[۳۸] هستند (Håkansson, Svensson et al. ۲۰۰۰, Permyakov and Berliner 2000) . این پروتئین جدا شده از شیر، برابر با مول‌های خود کلسیم متصل شده دارد که ساختار پروتئین را پایدار می‌کند (Kronman, Sinha et al. ۱۹۸۱, Rao and Brew 1989). آلفالاکتالبومین همچنین به دلیل داشتن ساختار گلبول ذوب شده^[۳۹] یک نمونه مناسب جهت بررسی نحوه تاخوردن پروتئین‌هاست زیرا مشابه حدواسط‌های اولیه تاخوردن پروتئین می‌باشد (Kuwajima, Hiraoka et al. ۱۹۸۵).

۱-۲- بتالاکتوگلوبولین شیر گاو
بتالاکتوگلوبولین (BLG) در حدود ۵۰ درصد از پروتئین‌های آب پنیر و ۱۲ درصد از کل پروتئین‌های شیر گاو را تشکیل می‌دهد. BLG پروتئین اصلی آب پنیر در شیر گاو، بوفالو^[۴۰]، گوسفند و بز است (اگر چه اندکی تفاوت‌های درون گونه‌ای وجود دارد). در ابتدا مشخص شد که BLG فقط در شیر نشخوار کنندگان وجود دارد ولی هم اکنون می‌دانیم که در شیر بسیاری از گونه‌های دیگر شامل: گوزن، خوک، کانگورو، اسب، میش، دلفین، گربه، نهنگ و سگ نیز وجود دارد (Pervaiz and Brew 1986). با این حال در شیر انسان، موش، خوکچه هندی و شتر دیده نشده است. آلفالاکتالبومین عمده‌ترین پروتئین آب پنیر در این گونه‌ها می‌باشد (Sawyer and Kontopidis 2000).
BLG پروتئین اصلی آب پنیر شیر گاو با غلظت متوسط ۳-۲ گرم در لیتر است (Kontopidis G, Holt et al. ۲۰۰۴). این پروتئین متعلق به خانواده پروتئینی لیپوکالین^[۴۱] است (Sawyer and Kontopidis 2000). لیپوکالین‌ها به طور کلی پروتئین‌های کوچکی با ۱۸۰-۱۶۰ اسیدآمینه هستند که همگی آن‌ها در یک‌ سری خواص با هم مشترک می‌باشند. آن‌ها می‌توانند با مولکول‌های آب‌گریز^[۴۲] کوچک پیوند برقرار کنند، کمپلکس‌هایی با ماکرومولکول‌های محلول دیگر ایجاد نمایند و به گیرنده‌های خاصی روی سطح سلول متصل شوند. همچنین نشان داده شده است که BLG گاوی به لیگاندهای کوچکی مانند اسید‌های چرب و ویتامین‌ها متصل می‌شود (Kontopidis George, Holt et al. ۲۰۰۲). اگرچه ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی این پروتئین به خوبی مشخص شده‌است ولی عملکرد‌های زیستی آن به طور کامل شناسایی و تایید نشده‌اند (Palmer 1934).
۱-۲-۱ لیپوکالین‌ها
در گذشته لیپوکالین‌ها تحت عنوان پروتئین‌های انتقال دهنده طبقه‌بندی می‌شدند، اگرچه اکنون طیف فعالیت وسیع‌تر آن‌ها شناخته شده است. علاوه بر فعالیت مشترک لیپوکالین‌ها، آن‌ها به صورت وسیع بر پایه تشابه توالی شناخته می‌شوند. الگوی تاخوردگی لیپوکالین‌ها بسیار مشابه است(شکل۱-۱). ساختار کریستالی لیپوکالین‌ها بسیار محافظت‌ شده است و از یک استوانه ۸ صفحه‌ای β ناهمسو^[۴۳] تشکیل شده‌است که یک محل اتصال لیگاند درونی را در بر می‌گیرند (Flower Darren R, North et al. ۲۰۰۰).
خصوصیات رایج شناساگری^[۴۴] آن‌ها شامل موارد زیر می‌باشد:
۱- اتصال به لیگاند^[۴۵]: به بسیاری از لیگاندهای هیدروفوب متصل می‌شوند که شکل و ساختار ویژه این پروتئین‌ها به میزان بسیار زیادی برای این کار مناسب به نظر می‌رسد (Flower Darren R et al. 2000).
۲- اتصال به گیرنده: بسیاری از لیپوکالین‌ها به گیرنده‌های سطح سلولی متصل شده و بعضی از آن‌ها ممکن است وارد سلول شوند. برای مثال کمپلکس رتینول-^[۴۶]RBP در سلول‌های پارانشیمی^[۴۷] کبد برداشت می‌شود (Flower Darren R et al. 2000).
۳- کمپلکس بزرگ مولکولی^[۴۸]: آخرین ویژگی شناساگری شناخته شده می‌باشد (Flower Darren R et al. 2000).
این پروتئین‌ها فعالیت‌های گسترده ای را هم انجام می دهند، برای مثال دارای فعالیت فرومونی^[۴۹] هستند و در ادرار جوندگان مقادیر بسیار زیادی از پروتئین‌های خانواده لیپوکالین (MUP^[50]) با فعالیت فرومونی به اثبات رسیده اند (Finlayson, Asofsky et al. ۱۹۶۵). عملکرد دیگر آن‌ها رنگ آمیزی^[۵۱] است که در بسیاری از پروتئین‌های این خانواده از جمله کروستاسیانین^[۵۲] موجود در میگو دیده شده است (Flower D 1996). این پروتئین‌ها در
شکل ۱-۱، خصوصیات تاخوردگی لیپوکالین‌ها. یک نمای پیچ نخورده از تاخوردگی لیپوکالین‌ها عمود بر محور بشکه بتا. ۹ صفحه غیرهمسوی بتا در قالب پیکان‌ها آورده شده‌اند و از A تا I نمایش داده شده‌اند. مارپیچ شبه انتهای N (علامت گذاری شده با ) نشانه گذاری شده است. پیوند هیدروژنی بین دو صفحه توسط نقطه‌چین‌ها مشخص گردیده‌اند و حلقه‌های متصل کننده با تا علامت‌گذاری شده‌اند. دو انتهای بشکه بتا مشخص هستند که یک انتها شامل ۴ سنجاق بتا (، ، و ) است که ورودی مکان اتصال لیگاند است و انتهای باز مولکول ^[۵۳]نام دارد. انتهای دیگر دارای ۳ سنجاق بتا (، و ) می‌باشد. این بخش‌ها ۳ منطقه بسیار محافظت شده^[۵۴] (SCRS) به نام های ، و را تشکیل می‌دهند. ۳ موتیفی که به این مناطق تعلق دارند در قالب MOTIF1، MOTIF2 و MOTIF3 نشان داده شده‌اند. در این میان موتیف اول از دیگران محافظت شده تر است، اما دو موتیف دیگر تنها در خانواده لیپو کالین‌های کرنلی^[۵۵] محافظت شده هستند( Flower D 1996).
سنتز پروستاگلاندین^[۵۶] (PG) نیز دخالت دارند و عامل اصلی درگیر در سنتز PGD2^[57] در مغز، تولید کننده PGD2 مستقل از گلوتاتیون^[۵۸] می‌باشد که یک لیپوکالین است (Nagata, Suzuki et al. ۱۹۹۱, Urade, Nagata et al. ۱۹۸۹). بسیاری از لیپوکالین‌ها هم در تنظیم سلولی نقش دارند مانند پروتئین خاموش سازی ویژه^[۵۹] (QSP) (Flower D 1996).
۱-۲-۲- ساختار مولکولی BLG گاوی
BLG در سلول‌های اپیتلیال^[۶۰] ترشحی غده پستانی، تحت کنترل هورمون پرولاکتین^[۶۱] تولید می‌شود (Larson 1972). RNA ای که مسئول کد کردن این پروتئین در غده پستانی است به پیش پروتئینی با ۱۸۰ اسیدآمینه ترجمه می شود و سپس پپتید پیام‌رسان ۱۸ اسیدآمینه‌ای بسیار محافظت شده، حذف می‌گردد (Yoshikawa, Mizukami et al. ۱۹۷۸). ساختار BLG از ۱۶۲ اسیدآمینه با وزن مولکولی تقریبی ۴/۱۸ کیلودالتن تشکیل شده‌است (Brownlow, Cabral et al. ۱۹۹۷)(شکل۱-۲). کریستالوگرافی^[۶۲] و مطالعات تقرق اشعه ایکس^[۶۳] نشان می‌دهد که BLG در حالت دایمر^[۶۴] تقریباّ به صورت بیضی کشیده شده با طول ۶۹ و عرض ۳۶ آنگستروم است و شعاع هر مونومر BLG به طور تقریبی ۱۸ آنگستروم^[۶۵] می‌باشد (Verheul, Pedersen et al. ۱۹۹۹). ساختار کروی مونومر^[۶۶] BLG در نتیجه توزیع یکنواخت دنباله‌های یونی، قطبی و غیر قطبی است که این امکان را برای دنباله‌های آب‌گریز فراهم می‌کند که در قسمت درونی پروتئین قرار گیرند.
LIVTQTMKGL DIQKVAGTWY SLAMAASDIS LLDAQSAPLR VYVEELKPTP EGDLEILLQK WENDECAQKK IIAEKTKIPA VFKIDALNEN KVLVLDTDYK KYLLFCMENS AEPEQSLVCQ CLVRTPEVDD EALEKFDKAL KALPMHIRLS FNPTQLEEQC HI
شکل۱-۲، توالی اسیدآمینه‌ای بتالاکتوگلوبولین گاوی نوع A ()
BLG به دلیل فراوانی بالا و خالص سازی^[۶۷] نسبتا راحت آن از شیر و تمایل طبیعی آن برای تشکیل بلورهای مناسب، از دیرباز موضوعات مورد مطالعه تفرق اشعه ایکس بلورهای پروتئینی بوده‌است. در سال ۱۹۸۶ اولین ساختار با وضوح متوسط^[۶۸] از BLG به چاپ رسید.
شباهت ساختاری به یک پروتئین به ظاهر متفاوت، پروتئین متصل شونده به رتینول پلاسما (RBP)، باعث توجه بیشتر به نقش BLG در شیر گاو شد. ساختارهایی با وضوح بیشتر باعث آشکار شدن حفره بتای ۸ رشته‌ای (کالیکس^[۶۹]) شد که توسط مارپیچ آلفا^[۷۰] احاطه می‌شود(شکل۱-۳). حفره بتا دارای دو مجموعه صفحه بتا است که رشته‌های A-D از یک سطح از کالیکس و رشته‌های E-H سطح دیگر آن را تشکیل می‌دهند (Kontopidis George et al. 2002). نهمین صفحه بتا (I) در کنار صفحه اول و در سطح بیرونی کالیکس قرار می‌گیرد (Qin, Bewley et al. ۱۹۹۸)(شکل۱-۳). رشته‌های بتای I، دو مونومر را با تشکیل یک صفحه بتای غیر موازی، به هم متصل می‌کنند(شکل۱-۴). مونومرها از طریق ۱۲ پیوند هیدروژنی که بین حلقه‌های^[۷۱] AB (۸ پیوند زنجیره جانبی و رشته‌های بتا I (۴ پیوند زنجیره اصلی) است، به یکدیگر متصل می‌شوند (Brownlow et al. 1997). علاوه بر صفحه I نیروی دیگر پایدار کننده دیمر شدن این پروتئین حلقه‌های AB است که یک جفت یونی ASP33 از یک زیر واحد و ARG40 از زیر واحد دیگر می‌باشد (Kontopidis G et al. 2004).
شکل۱-۳، واحد مونومری بتالاکتوگلوبولین گاوی نوع A. توالی رنگ آمیزی شده است و با رنگ آبی در انتهای N شروع شده و با رنگ قرمز در انتهای C پایان می‌یابد. صفحات بتا(A-I) و حلقه‌های متصل کننده(AB,BC,…) این صفحات نام گذاری شده‌اند. حلقه کمتر شتاخته شده GH به عنوان یک مارپیچ نشان داده شده است(Adams, Anderson et al. ۲۰۰۶).
ساختار ثانویه BLG با بهره گرفتن از چندین تکنیک آزمایشگاهی از جمله دورنگ نمایی دورانی^[۷۲] (Dong, Matsuura et al. ۱۹۹۸)، طیف سنجی مادون قرمز^[۷۳] (Fang and Dalgleish 1997, Subirade, Loupil et al. ۱۹۹۸)، و کریستالوگرافی (Brownlow et al. 1997) تعیین شده است. در پایگاه داده PDB^[74]، ۱۵ ساختار متفاوت تفرق اشعه ایکس و دو ساختار رزونانس مغناطیسی هسته^[۷۵] موجود می باشد. این ساختا از ۱۰ درصد مارپیچ آلفا، ۵۰ درصد رشته‌های بتا^[۷۶] و حدود ۲۰ درصد چرخش‌های معکوس^[۷۷] تشکیل شده است (Vetri and Militello 2005)(شکل۱-۵). هر مونومر دارای یک شعاع چرخشی در حدود ۵/۱ نانومتر می‌باشد (Carrotta, Arleth et al. ۲۰۰۳).
شکل ۱-۴، شکل فضایی برخورد سطح دیمری در BLG گاوی. ۴ پیوند هیدروژنی نشان داده شده در تمامی گونه‌های ساختار بلوری BLG یکسان هستند(Adams et al. 2006).
دو پیوند دی سولفیدی^[۷۸]، سیستئین^[۷۹] ۶۶ روی حلقه CD (رشته‌های C و D را به هم متصل می‌کند) رابه سیسیتئین ۱۶۰ در نزدیکی انتهای رشته C وسیسیتئین ۱۰۶ روی رشته G را به سیسیتئین ۱۱۹ روی رشته H متصل می‌کند و سیسیتئین ۱۲۱ به صورت یک تیول آزاد باقی می‌ماند. این سیسیتئین آزاد با گروه فعال تیولیش یک فعالیت وابسته به pH را در پروتئین گاوی نشان می‌دهد که در دناتوره شدن و تجمع^[۸۰] پروتئین نقش دارد. اولین پیوند دی‌سولفیدی نزدیک به سطح پروتئین و دومین پیوند دی‌سولفیدی در درون پروتئین تشکیل می شود. حلقه‌هایی که رشته‌های BC، DE، FG را به هم وصل می‌کنند نسبتاّ کوتاه ترند، در حالی که حلقه‌های متصل کننده رشته‌های AB، CD، EF، GH طولانی‌تر و انعطاف‌پذیرتر می‌باشند. پل‌های دی سولفیدی به همراه باندهای هیدروژنی ساختار سوم پروتئین را پایدار می‌کنند (Sakurai and Goto 2002).
ساختار چهارم پروتئین بسته به pH، دما و قدرت یونی بین مونومر، دیمر و یا الیگومر^[۸۱] تغییر می‌کند که در شرایط فیزیولوژیکی فرم دیمر غالب است (Gottschalk, Nilsson et al. ۲۰۰۳, Kumosinski and Timasheff 1966, McKenzie and Sawyer 1967). در pH زیر ۳ این پروتئین غالباّ مونومر است اما در pH بین ۵/۷-۲/۵ به شکل دیمر وجود دارد (Lozano, Giraldo et al. ۲۰۰۸).
شکل ۱-۵، شکلی شماتیک از ساختار ثانویه BLG (www.pdb.org).
این حالت های متغیر مولکول باعث ایجاد یک تعادل ظریف بین برهمکنش‌های آب‌گریز، الکترواستاتیک^[۸۲] و پیوند هیدروژنی می‌شود (Sakurai and Goto 2002, Sakurai, Oobatake et al. ۲۰۰۱). میزان pH در مقایسه با عوامل دیگر اثر بیشتری بر ساختار چهارم BLG دارد: در pH بین ۸-۵ دیمر پایدارترین ساختار BLG در دمای اتاق است اگرچه اشکال متراکم شده‌ای مثل تترامرها^[۸۳] نیز می‌توانند وجود داشته باشند (Hoffmann and van Mil 1999, Panick, Malessa et al. ۱۹۹۹). در pH زیر ۵/۳ و بیشتر از ۵/۷ پروتئین به فرم مونومر است که باعث می‌شود زیرواحدهای مونومر برهمکنش‌های غیراختصاصی مثل دافعه الکترواستاتیک داشته باشند. در pH ۵/۵-۵/۳ و به خصوص دمای پایین (۴) تراکم برگشت‌پذیر BLG باعث تشکیل اکتامر^[۸۴] می‌شود. در pH بالای ۸ تراکم برگشت‌ناپذیر و وابسته به زمان باعث می‌شود که BLG در نتیجه تشکیل باند‌های دی‌سولفیدی بین مولکولی، فرم‌های تترامری را در محلول ایجاد کند (Verheul et al. 1999).
۱۰ گونه^[۸۵] ژنتیکی در BLG گاوی شناسایی شده‌است که اصلی‌ترین آن‌ها گونه‌های B و A می‌باشند، که توالی اسیدآمینه‌ای آن‌ها به ترتیب در در ۲ موفعیت ۶۴ (Gly–Asp) و ۱۱۸ (Ala–Val) متفاوت است (Sawyer and Kontopidis 2000). تفاوت در توالی اسیدآمینه‌ای باعث تغییر در نقطه ایزوالکتریک^[۸۶] می‌شود (نقطه ایزوالکتریک گونه A در pH ۱/۵ و نقطه ایزوالکتریک گونه B در pH ۳/۵ می‌باشد) (Štastná and Šlais 2005).
گونه‌های ژنتیکی از نظر پایداری حرارتی (Manderson, Hardman et al. ۱۹۹۹)، دناتوره شدن القایی توسط فشار هیدرواستاتیک (Botelho, Valente‐Mesquita et al. ۲۰۰۰)، ویژگی‌های خودتجمعی^[۸۷] (Timasheff and Townend 1961) و انحلال‌پذیری (Treece, Sheinson et al. ۱۹۶۴) با یکدیگر متفاوتند.
ساختار گونه‌های A و B بسیار شبیه به یکدیگر هستند، هر چند نتایج جانشینی^[۸۸] Asp64Gly در حلقه CD ساختارهای فضایی متفاوتی را ایجاد می‌کند. اسیدآمینه‌ی موقعیت ۶۴ درست قبل از حلقه‌ی CD بسیار انعطاف‌پذیر قرار گرفته‌است، بنابراین هر تغییر ساختاری که به وسیله جهش ایجاد می‌شود توسط انعطاف پذیری حلقه CD پوشیده می‌شود. جانشینی Val118Ala در هسته آب‌گریز مولکول و نزدیک به حلقه GH رخ می دهد و کاهش دو گروه متیل منجر به بهبود تشکیل حفره در هسته آب‌گریز BLG نوع B می‌شود. این امر باعث هیچ گونه تغییر قابل تشخیصی در ساختار پروتئین نمی‌شود، اما فضای خالی به وجود آمده به وسیله جایگزینی گروه ایزوپروپیل^[۸۹] با گروه متیل کوچکتر در BLG نوع B، باعث کمتر پوشیده شدن حفره آب‌گریز این پروتئین می‌شود و در نتیجه پایداری حرارتی این گونه نسبت به نوع A کاهش می‌یابد (Qin et al. 1998). همچنین مطالعات غیرطبیعی شدن در فشار بالا نشان می‌دهد که نوع B از نظر ترمودینامیکی^[۹۰] نسبت به نوع A پایدارتر است (Botelho et al. 2000).
۱-۲-۳- عملکرد زیستی BLG
BLG متعلق به خانواده لیپوکالین‌ها است که بسیاری از آن‌ها پروتئین‌های انتقالی می‌باشند (Flower Darren R et al. 2000). ویژگی اصلی پروتئین‌های این خانواده، توانایی اتصالشان به مولکول‌های آب‌گریز کوچک است که پیوند این مولکول‌ها به حفره آب‌گریز باعث می‌شود تا تماس با حلال کاهش یابد (Flower D 1996, Pervaiz and Brew 1986).