ml 1 از محلول Tris-base (1M) را با ml 2/. از محلول EDTA 0.5M)) مخلوط و سپس ml 8/98 آب مقطر اضافه می کنیم .
EDTA 5/0 مولار
برای تهیه ml100 از EDTA ، ۶۱۲/۱۸ گرم از آن را کشیده و در حجم ml100حل می کنیم . برای رساندن PH به ۸ از بلورهای سود استفاده می کنیم .
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
بافرTES یا بافر لیز کننده هسته pH=(7.5)
NaCl(150mM)+
Tris-base(10mM)+
EDTA(10mM)
ml 4 از محلول EDTA(0.5M) برداشته و با ml 2 از محلول Tris-base ( 1M) و ml30از محلول نمک M1 مخلوط و حجم نهایی را با آب مقطر به ml 200 می رسانیم .
SDS 10%
۱۰۰گرم از سدیم دودسیل سولفات را با آب مقطر به حجم ml 1000 می رسانیم .
پروتئیناز K
۱/. گرم از پروتئیناز K را در ml 10 آب مقطرسرنگ حل می کنیم و هر یک میلی لیتر آن را در میکروویال ریخنه و در فریزر نگهداری می کنیم .
۳-۷-۱-۱ چگونگی استخراج DNA
جهت نمونه گیری، از افراد مبتلا، ۱۰-۴ میلی لیتر خون جهت استخراج DNA گرفته شد. در لوله های DNA از ماده ضد انعقاد EDTA ( Ethyen Diamin Tetra Acetic Acid) 5/0 مولار استفاده شد ( به ازای ۱۰ میلی لیتر خون ۲۰۰ میلی لیتر EDTA استفاده شد).
نمونه خون (۱۰ میلی لیتر) را دو قسمت کرده و نیمی از آن را داخل فریزر نگهداری کرده و نیم دیگر را برای استخراج به لوله فالکون اضافه می کنیم.
۳-۷-۱-۲ لیز سلول
به لوله حاوی خون دو برابر حجم (۱۰ میلی لیتر) آب مقطر سرد اضافه می کنیم ولوله را به شدت مخلوط می کنیم تا گلبول های قرمز لیز شوند و سپس به مدت ۲۵ دقیقه با دور ۳۰۰۰ سانتریفوژ می کنیم.
نمونه سانتریفوژ شده حاوی رسوب گلبول سفید وگلبول قرمز در محلول رویی است. با پیپت محلول رویی را خارج کرده تا به رسوب برسیم سپس با اضافه کردن ۱۰ میلی لیتر دیگر آب مقطر سرد و مخلوط کردن رسوب با آن و فیوژ کردن دوباره آن را سانتریفوژ می کنیم .
دوباره محلول رویی (اگر محلول رویی شفاف نبود می توانیم مرحله اضافه کردن آب مقطر سرد را ادامه دهیم تا تمام گلبول های قرمز پاره شوند) را از رسوب جدا می کنیم و ۵/۴ میلی لیتر از بافر لیزکننده TES به آن اضافه می کنیم. در آن مرحله توده باز شده و سوسپانسیون صافی ایجاد می شود (در صورت تمایل می توان در این مرحله کار را متوقف کرده و نمونه را در فریزر۲۰- درجه نگهداری کنیم). ۲۵/۰ میلی لیتر (۲۵۰میکرولیتر ) از SDS 10% اضافه می کنیم خوب لوله را سر وته می کنیم. حال ۱/۰ میلی لیتر(۱۰۰ میکرولیتر ) از پروتئیناز K به آن اضافه می کنیم و بخوبی مخلوط می کنیم.
لوله ها را به مدت یک شب ( ۳ تا ۲۴ ساعت ) در بن ماری ۳۷ درجه سانتیگراد یا ۲ ساعت در ۵۵ درجه سانتیگراد انکوبه می نمائیم. این مرحله باعث پاره شدن غشاء سلولی و هسته گشته و رشته های DNA آزاد می گردد.
بعد از مدت مقرر نمونه ها را از بن ماری در آورده و ۲ میلی لیتر نمک اشباع به آن اضافه می کنیم ( تقریباً یک سوم حجم خون مورد استفاده) و خوب تکان می دهیم (قبل از اضافه کردن نمک اشباع مخلوط را بخوبی تکان می دهیم).
حال نمونه ها را به مدت ۳۰ دقیقه در دور ۳۰۰۰ سانتریفوژ می کنیم. در این مرحلهDNA در مایع رویی به صورت محلول و رسوب حاوی پروتئین های تخریب شده می باشد. مایع رویی را با احتیاط به یک لوله دیگر اضافه می کنیم و رسوب را دور می ریزیم. به هر لوله به اندازه ۷/۰ حجم ایزوپروپانول ۱۰۰ درصد اضافه می کنیم (چون حجم لوله ما تقریباً ۷ سی سی است، ۵ سی سی ایزوپروپانول به آن اضافه می کنیم). نمونه ها را به آرامی سر وته می کنیم تا کلاف شفاف DNA ظاهر شود. الکل باعث جمع شدن و توده شدن رشته های DNA می گردد. به طوری که می توان این توده سفید رنگ DNA را با چشم غیر مسلح مشاهده کرد).
کلاف DNA را با کمک یک پیپت پاستور شیشه ای به یک میکروتیوپ ۵/۱ میلی لیتری منتقل می کنیم (هرگز برای جابجایی از پیپت پاستور پلاستیکی استفاده نمی کنیم چون پیپت پلاستیکی بارمثبت دارد و DNA بار منفی، بنابراین جذب یکدیگر شده و دیگر جدا نمی شوند).
نمونه را به مدت ۳۰ ثانیه در دور ۸۰۰۰ میکروفیوژ می کنیم. محلول رویی را دور ریخته و به کلاف DNA که در لوله رسوب کرده است ۱ میلی لیتر الکل اتانول ۷۰ درصد سرد اضافه می کنیم و لوله ها را تکان می دهیم تا DNA شستشو داده شود. سپس نمونه رابه مدت ۳۰ ثانیه با دور ۸۰۰۰ میکرو فیوژ می کنیم. مایع رویی را دور ریخته و دوباره ۱ میلی لیتر الکل اتانول ۷۰ درصد سرد به آن اضافه می کنیم وآن را تکان می دهیم و سپس با دور بالا میکروفیوژ می کنیم. سپس مایع رویی را دور ریخته و با نوک سمپلر الکل باقی مانده را از روی کلاف بر می داریم و به مدت نیم ساعت در مجاورت هوای آزمایشگاه قرار می دهیم تا الکل باقی مانده تبخیر شود.
۳-۷-۱-۳ هیدراسیون DNA
به رسوب حاصل حدود ۵۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر (بر حسب میزان توده DNA ) بافر TE اضافه می کنیم .DNA در بافر TE به صورت محلول در می آید (یک شب در دمای اتاق انکوبه می شود).
این DNA آماده PCR بوده و قابلیت سال ها نگهداری در یخچال را دارد. شستن نمونه با اتانل۷۰% جهت برداشت نمک های باقی مانده می باشد. باید توجه داشت که اگر مقداری اتانل همراه DNA باقی بماند، DNA حاصل در PCR تکثیر نمی شود و همچنین باید مواظب بود تا DNA بیش از اندازه خشک نشود چون در مرحله بعدی در بافر حل نمی شود. یکی از مشکلات ممکن در PCR ناشی از وجود بافر TE حل کننده DNA است که می تواند به نحو موثری غلظت Mg2+ را از طریق EDTA شلاته کننده، کاهش داده و PCR را مهار نماید. به نحو مشابهی DNA استخراج شده می تواند محصولات تجزیه را هم به همراه خود داشته باشد که با PCR تداخل نماید. SDS نیز در میزان بیشتر از ۱۰ درصد مهار کننده PCR می باشد و باید توسط استخراج و رسوب الکلی برداشته شود.
۳-۷-۲ تعیین غلظت DNA استخراج شده
به منظورارزیابی کمیت و کیفیت DNA و آگاهی از میزان غلظت و خلوص آن می توان از روش اسپکتروفتومتری استفاده کرد. یعنی میزان جذب اشعه UV توسط بازهای DNA را اندازه گرفت که روش ساده و دقیقی می باشد. مولکول های DNA به علت حضور بازهای آروماتیک آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین دارای جذب نوری زیاد در محدوده ماوراء بنفش می باشند. بنابراین اندازه گیری جذب نوری محلول های DNA شاخص خوبی برای درجه خلوص آن می باشد.
حداکثر جذب مولکول DNAدر طول موج ۲۶۰nm است. از طرفی معمولاً محلول های DNA مقداری آلودگی پروتئینی دارند که حداکثر جذب محلول های پروتئینی نیز به علت حضور اسیدهای آروماتیک مانند فنیل آلانین، تیروزین، تریپتوفان در طول موج ۲۸۰nm میباشد. بنابراین نسبت جذب در طول موج ها ۲۶۰/۲۸۰ را مشخص می کنند. جذب نوری (OD) معیار مناسبی برای تعیین نسبت Protein/DNA در یک نمونه و به عبارتی درجه خلوص خواهد بود. به همین علت جهت تعیین غلظت DNA محلول، باید جذب آن را در طول موج های ۲۶۰nm و ۲۸۰مشخص نمود. OD خوانده شـده در ۲۶۰nm نشان دهنده غلظت DNA در محلول و OD در طول موج ۲۸۰nm نشانه مقـدار آلـودگی با پروتئین است. نسبت ۲۶۰/۲۸۰ OD محـاسبه می گردد و هرگاه این نسبت دارای میانگین ۸/۱ (۲- ۷/۱) باشد حاکی از خلوص خوب DNA است. بهترین نسبت ۲ می باشد و در صورت آلودگی زیاد با پروتئین مانند هم (Heme) یا مواد آروماتیک مانند فنل، این نسبت به طور چشمگیری کاهش می یابد (نسبت بیش از ۲ احتمال آلودگی با RNA را نشان می دهد).
۳-۷-۲-۱ روش تعیین غلظت DNA:
محلول DNA را با بهره گرفتن از محلول TE رقیق می کنیم. ۵ میکرولیتر از محلول DNA را با ۹۵ میکرولیتر از محلول TE مخلوط می کنیم. برای کالیبره کردن دستگاه از ۱۰۰ میکرولیتر TE به عنوان بلانک استفاده می شود. سپس جذب نوری را در طول موج ۲۶۰ و۲۸۰ نانومتر می خوانیم. نسبت این جذب در هر مورد محاسبه می شود. این نسبت برای تمامی نمونه های DNA در این بررسی، بین ۷/۱ تا ۹/۱ بود که کیفیت خوب DNA را نشان می دهد. دستگاه غلظت DNA را هم به ما نشان می دهد.
۳-۷-۲-۲ نحوه خالص سازی نمونه های آلوده به پروتئین
روش کار شامل مراحل زیر می باشد: