C^—
۲
۲
۱
شکل۵-۳- واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

L: مارکر Kb1، ۱: hrpW، ۲: hrpG
تایید ناقل­های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II
با توجه به اینکه ناقل­های مذکور از گروه‏های پژوهشی موجود در مرکز ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری و همچنین پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی تهیه شده، لذا، می­بایست از هویت آنها اطمینان حاصل می­شد که بدین منظور و با بررسی توالی ناقل­های مربوطه موجود در بانک اطلاعاتی NCBI توسط برنامه Vector NTI مشخص گردید که تنها یک جایگاه برای هر کدام از آنزیمهای برشی SacI , XbaI به ترتیب در نوکلئوتیدهای ۳۱ و۹۱ مربوط به جایگاه همسانه‏سازی pGEM7zf(-) و همچنین جایگاه ۵۸۱۵ و۷۷۱۵ از pBI121 وجود دارد. علاوه بر آن جایگاه‏های BamHI , XbaI نیز در موقعیت ۲۵۷ و ۲۶۳ مربوط به توالی جایگاه همسانه‏سازی ناقل pUC19 به‏صورت یگانه می­باشند. به‏دنبال این موضوع واکنش هضم آنزیمی با آنزیم­ های مذکور و بر روی ناقلین مربوطه صورت گرفت که نتایج حاصله از هضم دوتایی هر کدام در شکل (۶-۳) قابل مشاهده می­باشد، که تایید کننده ناقلین مورد استفاده و در راستای اطلاعات نظری حاصل از سایت­های اطلاعاتی مربوطه می­باشد.
۱۳۷۵bp
۳۰۰۰bp
۲۷۹۳bp
۲۷۹۹bp
۱.۸kb
۱۳.۸kb
۱۲kb
۴
L
۳
۲
۱
۶
۵
شکل۶-۳- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقلین کلونینگ و بیانی با آنزیم­ های برشی نوع II بر روی ژل آگارز ۱%
L: مارکر Kb1، ۱: هضم دوتایی pUC19، ۲: pUC19 بدون برش، ۳: هضم دوتایی pGEM7zf(-)، ۴-۵: هضم دوتایی pBI121 (BamHI , XbaI)، ۶: هضم دوتاییpBI121 (SacI , XbaI).
همسانه‏سازی ژن­هایhrpG و hrpW در ناقل­های کلونینگpGEM7zf(-) و pUC19
با دریافت توالی کامل پلاسمید pGEM7zf(-) با شماره دستیابی X65311 و همچنین pUC19 از سایت NCBI، طراحی آنها در برنامه رایانه­ای Vector NTI انجام شد. جهت همسانه‏سازی ژن hrpW در pGEM7zf(-) و همچنین hrpG در pUC19 ابتدا این ناقل‏ها را با کشت باکتری میزبان آنها یعنی E.coli بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی‏بیوتیک آمپی‏سیلین و همچنین X.gal 2% و IPTG 20% به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه قرار دادیم با ظهور کلون‏های آبی رنگ و کشت از آنها، پلاسمیدهای موردنظر استخراج شدند و پس از آن به منظور کلون کردن ژن­های مذکور در این ناقل­ها جهت حفظ و نگهداری آن در ناقل با تعداد کپی بالا، فراورده تکثیر شده و ناقل مربوطه با آنزیم‏های XbaI / BamHI , XbaI / SacI و به مدت ۴-۳ ساعت در بن‏ماری با دمای ۳۷ درجه هضم شدند، که پس از آن با بردن محصول بر روی ژل آگارز ۱% و بازیابی، تعیین غلظت و کیفیت آن با الکتروفورز ۵ مایکرولیتر از محصول بازیابی شده نسبت‏های ۱ به ۳ را برای pGEM/hrpW و نسبت ۱ به ۴ برای pUC19/hrpG جهت انجام واکنش اتصال انتخاب شد.
L
۴
۳
^‘
L
۱
۲
۷۹۲bp
۹۱۲bp
۹۱۲bp
۷۹۲bp
الف
ب
شکل۷-۳- هضم آنزیمی فراورده ژن­های hrpG , hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز )الف) و قطعات بازیابی شده (ب)
L: مارکر Kb1، ۱: hrpW، ۲: hrpG، ۳: قطعه‏ی برش خورده hrpW، ۴: قطعه‏ی برش خورده hrpG

L
۴
۳
۲
۱
L
۲۷۹۹bp
۳۰۰۰bp
۳۰۰۰bp
۲۷۹۹bp
ب
الف
۱
شکل۸-۳- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)