منابع دانشگاهی و تحقیقاتی برای نگارش مقاله بررسی تاثیر کشت همزمان سلول … – منابع مورد نیاز برای مقاله و پایان نامه : دانلود پژوهش های پیشین

ارسال شده در 16 تیر 1401 توسط نویسنده محمدی در بدون موضوع

۲-۱۳-۲- مسیرهای آپوپتوزی
ملکولهای متعددی در فرایند آپوپتوز درگیر هستند. تحریک ملکولهای پروآپوپتوزی و یا مهار فاکتورهای آنتی آپوپتوتیک بستگی به نوع سلول و محرک دارد. دو مسیر اصلی آپوپتوز، مسیر خارجی یا مسیر وابسته به گیرندههای مرگ و مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی و یک مسیر فرعی آن، آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳ میباشد .(Hashemi & Kroczak., 2005, Xu G & Shi Y., 2007)

1. مسیر خارجی یا آپوپتوز القاء شده توسط گیرندههای مرگ

در غشاء پلاسمایی اغلب سلولها گیرندههای مرگ وجود دارد. گیرندههای مرگ، اعضاء ابر خانواده گیرندهفاکتور نکروز دهنده میباشند. زمانی که این گیرندهها توسط لیگاندهای مربوطه تحریک میشوند، سبب فعال شدن کاسپازها و القاء آپوپتوز میگردند. ویژگی این ابر خانواده وجود توالی غنی از سیستئین در بخش خارج سلولی است. این گیرندهها در بخش سیتوپلاسمی خود دارای توالی به نام ناحیه مرگ بوده و ازاین رو در انتقال پیام آپوپتوزی به درون سلول شرکت مینمایند. شناختهترین گیرندههای مرگ عبارتند از :
Apo1, NFR1, TR2/Fas/CD95, R2-TRAIL/R1, DR5- TRAIL/DR4
تحریک گیرندههای مرگ توسط لیگاندهای مربوطه، منجر به تریمریزاسیون گیرنده و بهکار گیری پروتئینهای آداپتور میگردد. برای مثال لیگاند(CD95L) با گیرنده مربوط به خود(CD95R) میانکنش نموده باعث القاء تریمریزاسیون آن می شود. این عمل باعث تشکیل خوشه مرگ در ناحیه سیتوزولی گیرنده گردیده و باعث میشود که پروتئینهای آداپتور از قبیل FADD /Mort1 به آن متصل شوند. FADD دارای ناحیه مرگ(DD) در قسمت C ترمینال خود میباشد که این پروتئین را قادر میسازد تا به گیرندهتریمریزه شده از طریق میان کنش ناحیه مرگ- ناحیه مرگ متصل گردد. همچنین این پروتئین در ناحیه N- ترمینال دارای ناحیه مو^ءثر مرگ (DED) میباشد که با ناحیه DED مشابه در پرودمین کاسپاز -۸ میانکنش می کند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

به این کمپلکس پروتئینها(مجموعه لیگاند گیرنده مرگ، مولکول آداپتور و پروکاسپاز) کمپلکس علامت دهندهالقاء مرگ(DISC) گفته می شود. به این طریق پروکاسپاز-۸ به کاسپاز-۸ فعال تبدیل می شود. کاسپاز-۸ سبب فعال شدن کاسپازهای اجرایی شده و در نتیجه فرایند آپوپتوز صورت میگیرد(Delirezh, 2000).
۲- مسیر داخلی آپوپتوز یا مسیر میتوکندریایی
میتوکندری هم در حیات و هم در مرگ سلول دخالت دارد. این ارگانل انرژی سلول را به فرم ATP فراهم میسازد، هوموستاز داخل سلولی را در ارتباط با یونها و استرسهای اکسیداتیو حفظ مینماید. در پاسخ به سیگنالهای مرگ سلولی، نفوذپذیری غشاء خارجی میتوکندری سبب آزاد شدن مولکولهای پروآپوپتوتیک از قبیل فاکتور القاء کننده آپوپتوز (AIF) و سیتوکروم c، DIABL/ Smac و آندونوکلئاز G از فضای بین دو غشاء میتوکندری به داخل سیتوپلاسم می شود.(Adrain & Martin., 2001)
DIABLO/Smac اثر آنتاگونیستی روی مهار کنندگان کاسپاز دارد. فاکتور القاء کننده آپوپتوز(AIF) یک فلاوپروتئین ۵۷ کیلودالتونی است که در حالت طبیعی نقش آنتیاکسیدانی در میتوکندری برعهده دارد. بیان شده است که AIF آزاد شده از میتوکندری در طی روند آپوپتوز سبب آسیب به DNA هستهای در مسیر مستقل از کاسپاز می شود(Du et al., 2000).
به نظر میرسد که آزاد شدن سیتوکروم c یک واقعه معمول درآپوپتوز است و مکانیسمی که آزاد شدن آن را کنترل می کند در دست بررسی است. مکانیسمهای احتمالی شامل باز شدن منفذ انتقال نفوذپذیری میتوکندریایی، وجود کانال اختصاصی برای سیتوکرومc در غشاء خارجی میتوکندری و یا تورم و پاره شدن شدن غشاء خارجی میتوکندری بدون از دست دادن پتانسیل غشائی میباشد. ۱-Apaf در حالت عادی در سلول به صورت بی اثر و غیر فعال حضور داشته و در پروسه آپوپتوز به سبب رهایی سیتوکروم c از میتوکندری فعال میگردد. این پروتئین در ناحیه انتهای آمینی دارای دومینCARD و در انتهای کربوکسیلی دارای چندین بخش تکراری از موتیف ۴۰ – WDمیباشد. برای فعال شدن پروتئین ۱-Apaf ایجاد میان کنش بین این پروتئین و سیتوکروم c ضروری است(Hengartner., 2000).
با مکانیسمی که به درستی مشخص نیست، سیتوکروم c و ATP/dATP باعث الیگومریزه شدن ۱-Apaf میگردند. توالی CARD پروکاسپاز-۹ با نسبت یک به یک به ناحیه CARD در ۱-Apaf متصل گشته و سبب فعال شدن کاسپاز-۹ می شود، کاسپاز-۹ فعال سبب فعال شدن کاسپازهای اجرایی از قبیل کاسپاز ۳ و ۷ می شود. مجموعه پروتئین ۱-Apaf، سیتوکروم c و پروکاسپاز -۹ را آپوپتوزوممینامند. در مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی کاسپاز آغازگر کاسپاز-۹ میباشد. کاسپاز-۹ سبب فعال شدن کاسپاز های اجرایی (کاسپاز۳، ۶ و۷) میگردد و در نتیجه کاسپازهای اجرایی روی سوبستراهای خود عمل مینمایند و فرایند آپوپتوز صورت میگیرد.
۳-آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳
در برخی از ردههای سلولی آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳ صورت میگیرد. لنفوسیتهای Tسیتوتوکسیک و سلولهای کشندهطبیعی ممکن است مستقیما از طریق مسیر وابسته به رسپتور کاذب در سلولهای هدف ایجاد آپوپتوز نمایند. در این حالت گرانولهای محتوی گرآنزیمB (GrB) که یک سرین پروتئاز است همراه با پرفورین تحویل غشاء پلاسمایی سلولهای هدف داده می شود. پرفورین پروتئینی است که سبب ایجاد حفره در غشاء پلاسمایی می شود و اجازه میدهد که گرآنزیم آبشاری فعال شدن کاسپازها را به راه اندازد. کاسپازها جزء خانوادهسیستئین پروتئاز هستند که نقش محوری در شروع و فاز اجرایی آپوپتوز ایفاء می نمایند. بهدنبال فعال شدن، این آنزیمها روی سوبستراهای خاصی عمل نموده و تغییرات بیوشیمیایی و مورفولوژیک در سلول آپوپتوتیک ایجاد مینمایند. از جمله چروک شدن سلول، متراکم شدن کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و… بنابراین ارزیابی فعالیت کاسپاز به عنوان یک مارکر بیوشیمیایی آپوپتوز مطرح است.
۲-۱۴-ویتامین^[۴۹]
کلمه ویتامین از واژه یونانی ویتا به معنی زندگی گرفته شده است. ویتامینها از جمله ترکیبات آلی هستند که در مقدار خیلی کم، برای اعمال حیاتی بدن و رشد و نمو موجود زنده ضرورت دارند. تغذیه ناقص و رژیم غذایی نامناسب اغلب سبب کمبود یا فقدان یک یا چند ویتامین در بدن موجود زنده می‌شود و به بیماری‌های مختلف مانند بری بری و پلاگر می‌ انجامد. اغلب عمل آنها بر روی بافتهای اپی تلیال و استخوان بوده و در مجموع هر کدام از آنها از بروز یک عارضه جلوگیری می‌کنند. فونک نام Vitalamine، یعنی آمینی که حیاتی بوده و برای ادامه زندگی ضرورت دارد، را به موادی که سبب بهبود بیماری بری بری می‌شدند و از گروه آمین بودند اطلاق کرده بود. پس از آنکه معلوم شد بسیاری از ویتامینها از گروه آمین نیستند حرف e از آخر واژه ویتامین حذف و واژه Vitamin مورد قبول واقع شد.
۲-۱۴-۱- انواع ویتامین
ویتامینها در دو دسته ویتامینهای محلول در آب و ویتامینهای محلول در چربی قرار میگیرند. ویتامین E، ویتامین K، ویتامین Dو ویتامین A از جمله ویتامینهای محلول در چربی و ویتامین C و ویتامین‌های گروه B را محلول در آب میباشند.
۲-۱۴-۲- ویتامین D
ویتامین D به معنای دقیق کلمه ویتامین نیست و نامی است که به گروهی از پیش‌سازهای هورمون‌های^[۵۰] محلول در چربی داده‌اند. پیش‌سازهای هورمون‌ها، معمولاً خودشان فعالیت هورمونی اندکی دارند. دو شکل عمده ویتامین D در بدن انسان شامل ویتامین D2 یا ارگوکلسیفرول و ویتامین D3 یا کوله کلسیفرول میباشد. ویتامین D3 به‌ طور طبیعی هنگامی توسط بدن ‌تولید می‌شود که پوست در معرض نور فرابنفش موجود در پرتو‌های آفتاب قرار می‌گیرد. ویتامین D2 و ویتامین D3 به‌صورت تجاری هم تولید می‌شوند. فرم فعال ویتامین D در بدن، یعنی ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 یا کلسیتریول، از ویتامین D2 یا ویتامین D3 ساخته می‌شود. برای ساخته شدن این فرم فعال، ویتامین D2 و ویتامین D3 در کبد تغییر می‌یابند تا ۲۵ – Hydroxyvitamin D تولید شود، که این ماده از طریق خون به کلیه‌ها می‌رسد و در آنجا باز هم تغییر نموده و به‌صورت ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 درمی‌آید(Bell TD et al;2010).
هیدروکسیله کردن کوله کلسی فرول و تبدیل آن به کلسی دیول در کبد
هیدروکسیله کردن کلسی دیول تبدیل آن به کلسی تریول در کبد
ویتامینD3 به رشد و استحکام استخوان‏ها از طریق کنترل تعادل کلسیم و فسفر کمک می‌کند. ۱۰ تا ۲۰ دقیقه ماندن در زیر نور آفتاب، نیاز روزانه بدن انسان به این ویتامین را تامین می‌کند(شهبازی ملک نیا،۱۳۹۱).
مطالعات اپیدمیولوژی نشان می دهند در مناطقی که در معرض بیشتر نور خورشید هستند، به دلیل نقش مهمی که اشعه ماورا بنفش در تولید ویتامینD3 دارد، شیوع بیماریهای خودایمن کمتر است(,۲۰۰۶٫Cantorna). این ویتامین با ایجاد افزایش جذب فسفر و کلسیم از روده‌ها و کاهش دفع از کلیه به متابولیسم استخوان‌ها کمک می‌کند و همچنین از طریق ترجمه ژنهای هسته سلول، به رشد سلول کمک می‌کند. همه اعضای خانواده هورمونهای استروئیدی در تنظیم بیان ژنها نقش دارند(Smyk et al 2013). شیوع کمبود ویتامینD3 به خصوص در زنان و کودکان ایرانی بین ۵۰ تا ۸۰ درصد است. کمبود این ویتامین باعث پوکی استخوان در کهن سالی، باعث بروز بیماری‌هایی مانند راشیتیسم در کودکان، استئومالاسی در بزرگسالان، افزایش احتمال ابتلا به سرطان سینه یا پروستات شده و در نهایت باعث می‌شود که دستگاه ایمنی بدن ضعیف شود(Schwarz et al.,2005). ویتامین D3دارای اثرات متعددی بر سیستم ایمنی بدن میباشد و گیرنده این هورمون در بسیاری ازسلولهای ایمنی شامل ماکروفاژ، سلولهای دندریتیک، لنفوسیتها و سلولهای NK بیان می شود(van Etten et al.,2005). وقوع بیماریهای خود ایمن از قبیل MS و IBD در کشورهای پیشرفته طی ۵۰ سال اخیر افزایش چشمگیر یافته است( Cantorna et al.,2010). برای توجیه افزایش وقوع چنین بیماریهای خود ایمن با محدودیتهای جغرافیایی به فاکتورهای محیطی متعددی اشاره شده است. در این بین توجه زیادی به نقش ویتامین ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 به عنوان یک ترکیب تعدیل کننده سیستم ایمنی شده است(Carlson et al.,2013). مجموعه اثرات کاهش فعالیت در فضای باز، افزایش جمعیت و رژیم غذایی که دارای مقدار کافی ویتامینD نمی باشد موجب ایجاد یک نوسان بزرگ در میزان ویتامینD موجود در میان جمعیت کشور های پیشرفته و به ویژه در میان جمعیتهایی که فصل زمستان طولانیتری را میگذرانند، شده است(Namgung et al.,1995). همچنین مصرف ویتامین D3 در سلامت مغز و جلوگیری از آلزایمر موثر است. تحقیقات اخیر نشان می دهند که ویتامین D3 که شکل فعال ویتامین D میباشد در تعدیل پاسخهای ایمنی نقش دارد. در جوامعی که غذاهای سرشار از ویتامین D مصرف می کنند شیوع بیماریهای خود ایمن کمتر است و این خود شاهدی بر خاصیت تعدیل ایمنی توسط ویتامینD3 و ارتباط آن با سیستم ایمنی میباشد(VanAmerongen et al.,2004).
فصل سوم:
مواد وروش کار
Materials & Methods
۳- مواد و روش کار
این فصل به بیان و شرح مواد، لوازم و روشهای بکار گرفته شده در روند آزمایشگاهی بررسی حاضر می پردازد. تمام مراحل آزمایشگاهی از جمله کشت سلول بنیادی مزانشیم رت، برداشت مایع رویی سلول و تستهای انفجار تنفسی، فاگوسیتوز و آپوپتوز در آزمایشگاه ایمنی شناسی، آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی و مرکز تخصصی کشت سلول بخش ایمنیشناسی(در جریان هوای هود لامینار) گروه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی ارومیه صورت گرفت. از طرفی حیوانات آزمایشگاهی (رت) در مرکز نگهداری و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی ارومیه پرورش و نگهداری شد. در این مطالعه، به جهت ایجاد اختلاف کم در نژاد رتهای مورد آزمایش، به منظور تیمار سلول مزانشیم و مجاور سازی با سلول نوتروفیل، اقدام به پرورش و تکثیر این حیوان در مدت ۷-۶ ماه قبل از انجام پروژه نمودیم. از موشهای سن ۸-۶ هفته جهت استحصال سلول مزانشیم و از سن ۶-۵ ماهه برای خونگیری استفاده شد.
۳-۱- طرز تهیه محیط کشت DMEM
مواد و وسایل مورد نیاز